蛇床子提取物对黄瓜枯萎病菌抑制效果的研究

马丽娟　周宝利　张淑红　付亚文

摘要从蛇床子中提取抑制黄瓜枯萎菌的活性成分，正交优选提取条件，并在不同浓度下测定其抑制效果。结果表明，在室温下，95％乙醇连续超声提取3次，每次45 min为宜；当提取物浓度为10 mg/mL时，菌丝生长抑制率达78.65％；浓度大于100 mg/L时，孢子萌发抑制率为100％；浓度为8 mg/mL时，相对防效为40.95％。

关键词黄瓜；枯萎病菌；植物提取物；蛇床子；抑菌活性

中图分类号S 436.421

黄瓜枯萎病[Fusarium oxysporum (Schl.)f.sp.cucumerinum Owen]是设施栽培中常见的土传病害，在我国普遍发生。一般年份发病率在20％～35％，严重时甚至绝产。传统防治方法造成的“3R”(resistance，resurgence，residue)现象，使人们转向研究以“环境友好的天然农药”来替代化学合成农药。利用天然植物提取物的抑菌作用来防治园艺作物真菌性病害，是近年来国内外研究的热点。研究表明，蛇床子提取物有一定的杀虫抑菌作用。目前，国内外有关蛇床子提取物的研究主要在医学与蛇床子素抑菌方面，针对某种特定病菌的抑菌有效性研究尚少见报道。

本研究是在试验筛选的基础上，以蛇床子提取物对黄瓜枯萎菌的抑菌效果为指标，对蛇床子的超声波提取工艺条件设计了正交试验。细分不同浓度提取物，对黄瓜枯萎病菌的室内外抑制效果进行研究。本试验通过天然植物蛇床子提取物的抑菌作用来提高黄瓜对枯萎病的抗性，对植物源农药的开发利用具有一定实用价值。

1材料与方法

1．1供试材料

供试黄瓜枯萎菌(F.oxysporum f.sp.cu-cumerinum)取自沈阳农业大学植物保护学院，按照柯赫氏法则对其进行分离鉴定。黄瓜品种为津春4号，采用基质栽培，常规管理。蛇床子(Fructuscnidii)购自沈阳农业大学附属医院，粉碎过40目筛(孔径0.37 mm)后备用。化学试剂均为分析纯。所用培养基为马铃薯(琼脂)蔗糖PSA/PS培养基。试验对照农药为15％多·混氨酮悬浮剂(金吉尔灭萎)购自沈阳市金点园艺有限公司。

1．2研究方法

1．2．1提取方式的筛选

为了系统考察蛇床子中对黄瓜枯萎病抑制活性物质的提取工艺，根据蛇床子有效成分的性质设计了因素与水平(表1)。

测定方法同1．2．2。

1．2．2蛇床子提取物对黄瓜枯萎菌菌丝生长的影响

采用菌丝生长速率法，测定蛇床子提取物对黄瓜枯萎菌菌丝生长的影响。将1 mL植物提取物加入到49 mL已融化并冷却至40℃的PSA灭菌培养基中，混合均匀后制成平板，以纯PSA培养基作为对照(CK₀)，药剂500倍液为对照1(CK₁)，95％乙醇为对照2(CK₂)，每处理重复4次。在无菌条件下，接种d=0.638 cm经纯培养的枯萎菌菌丝圆片，24℃下暗培养，4 d后用十字交叉法测定菌落直径，并计算抑菌率。

菌丝生长抑制率=1-[(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径]×100％。

1．2．3蛇床子提取物对黄瓜枯萎菌孢子萌发的影响

采用孢子悬滴培养法，测定蛇床子提取物对黄瓜枯萎菌孢子萌发的影响。分生孢子悬浮液的制备：在已灭菌的200 mL PS培养基中接入4片d=0.638 cm经纯培养的枯萎菌菌丝圆片，在振荡培养箱中24℃振荡培养14 d，过滤离心，取下层孢子溶液用无菌水稀释，在低倍显微镜下一个视野约50个孢子，约为1×10⁵个/mL，放入冰箱中备用。

将不同浓度提取物分别稀释50倍，取10μL稀释液与10μL黄瓜枯萎菌分生孢子悬浮液于载玻片上混合(质量浓度为10 mg/mL)，经24℃保湿悬滴培养，16 h后镜检，记录孢子萌发数量和总孢子数量，计算萌发率。以清水处理作为空白对照(CK₀)，药剂500倍液为对照1(CK₁)，95％乙醇为对照2(CK₂)，每处理重复6次。

孢子萌发率=(孢子萌发数量/总孢子数量)×100％。

1．2．4蛇床子提取物对田间黄瓜枯萎病发病情况的影响

试验于2007年3月中旬至6月初进行。经温汤浸种后将种子播于育苗盘。待子叶展平，且露真叶时，分苗于12 cm×12 cm育苗钵中。当四叶一心时，对植株进行伤根接菌，每株50 mL浓度为l×10⁶个/mL的分生孢子悬浮液。接菌5 d后，分别用浓度为1、2、4、8 mg/mL的植物提取物处理幼苗，每株25 mL，共处理4次，每次间隔3天，以清水处理作为空白对照(CK₀)，浇25 mL15％多·混氨酮悬浮剂500倍液为对照1(CK₁)，最后一次处理后第3天调查发病情况，并计算病情指数及其相对防治效果。每个浓度处理10株苗，3次重复。

黄瓜枯萎病分级标准如下：

O级：全株无病；工级：发病轻微，全株有1/4以下的叶片出现萎蔫状；Ⅱ级：发病较重，全株有1/4～1/2的叶片出现萎蔫状；Ⅲ级：发病重，全株有1/2以上的叶片出现萎蔫状；Ⅳ级：因病枯死或接近死亡。

发病率=(发病植株数量/调查植株数量)×100％；

病情指数=[∑(病级株数×发病等级)/(调查总株数×最高等级代表值)]×100；

相对防效=[(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数]×100％。

2结果与分析

2．1正交试验及方差分析结果

根据L₉(3⁴)正交试验的排列组合(表2)。各取蛇床子10 g，共9份，精密称量，随机取样编号为1～9号，按每个试验号的要求进行试验。用10 mL95％乙醇定容。提取液与蛇床子粉末的比例为5倍剂量。

由表2可以看出R_A＞R_C>R_D>R_B。由此可知，提取药剂是影响提取率的重要因素，其次为提取次数和提取时间，影响相对较小的因素是提取温度。再根据K值进行分析得出，A₃优于A₁、A₂；B₁优于B₂、B₃C₃优于C₂、C₁；D₃优于D₁、D₂。因此，蛇床

子抑制黄瓜枯萎菌活性成分提取工艺条件为A₃B₁C₃D₃。

将测得的蛇床子抑菌直径进行方差分析，结果见表3。

从方差分析结果可知，A、C和D因素在统计学上有意义(p＜0.05)，可以选择与这三因素相关的提取工艺。B因素无统计学意义(p＞0.05)，选任意水平均可，但从节约能源和成本方面考虑，选1水平为好。综上所述，从水平和测试项目分析可得最佳提取条件为A₃B₁C₃D₃，即以95％乙醇为提取溶剂，采用室温超声提取。提取3次，每次45 min。合并3次提取液，旋转蒸发浓缩至膏状，以10 mL 95％乙醇定容，所得粗提物浓度为1 g/mL。

2．2蛇床子提取物对黄瓜枯萎菌菌丝生长和孢子萌发的影响

表4数据显示，不同浓度植物提取物对菌丝生长抑制率均在50％以上，并随着浓度的升高抑制能力逐渐加强。在提取物浓度为10 mg/mL时抑制率为78.65％，比药剂对照抑制率低4.26％，浓度为20 mg/mL时抑菌能力有所减弱。当提取物浓度为100 mg/L时，黄瓜枯萎菌孢子萌发抑制率为100％，随着浓度的增大病菌孢子同样不能萌发，结果同药剂处理。95％乙醇对黄瓜枯萎菌的菌丝生长和孢子萌发都存在一定的抑制作用，其对孢子抑制率为36.7％。

2．3蛇床子提取物对黄瓜枯萎病田间发病情况的影响

由表5可以看出，津春4号黄瓜品种自身对枯萎病有较强的抗性，空白对照的发病率仅为48.39％。在此基础上，浇灌植物提取物，当浓度为1 mg/mL时，发病率为40％，且随着施用浓度的增大发病率逐渐减小。当浓度为8 mg/mL时，发病率为26.67％，与药剂对照相差约6％，病情指数相差近10％。相对防治效果也随着提取物浓度的加大而升高。当浓度为1 mg/mL时，相对防效仅为8.15％，但当浓度为8 mg/mL时，相对防效达40.95％。

3讨论

蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床[Cnidiummonnieri(L.)Cusson]的干燥成熟果实，主要含有挥发油及蛇床子素等香豆素类成分。传统提取方法采用水煎煮、醇提或石油醚提取，提取能力差，有效成分损失严重，杂质多。超声提取原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出和释放，且其具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等特点。试验表明，提取溶剂对天然植物有效成分的提取有着重要作用。且在提取溶剂总量不变的情况下，多次提取更有利于活性成分的渗出，但与提取时间长短关系不显著。本工艺有利于蛇床子抑制黄瓜枯萎菌有效成分的提取，且操作简便易行，适合于今后近一步研究并应用于园艺作物生产。

黄瓜枯萎病是设施黄瓜生产上的重要病害，近年来由于设施栽培面积的不断扩大，其发病趋势也随之加大。本试验以蛇床子提取物抑制黄瓜枯萎病菌，在所设浓度内对菌丝生长抑制率均在50％以上，当浓度为10 mg/mL时抑制率为78.65％，高于其他浓度。这说明抑制有效浓度在此范围内，提高浓度则效果不显著。在浓度为100 mg/L时，对孢子萌发有显著的抑制作用，表现为孢子畸形生长。95％乙醇对照亦能在一定程度上抑制黄瓜枯萎菌的菌丝生长和孢子萌发，但对比植物提取物和药剂仍有明显的差距。药剂对照与所设浓度最高抑制率相差4％，说明生物抑菌有很大的研究价值和发展空间。

结合抗病品种津春4号的遗传优势，以天然植物蛇床子提取物灌根处理幼苗，当浓度为1 mg/mL时，相对防效仅为8.15％。但随着浇灌浓度的增大，相对防效以10％以上的梯度递增，当浓度为4 mg/mL时增长稍缓，浓度为8 mg/mL时相对防效达到40.95％，且有一定的增长空间。关于田间施用的最佳提取物浓度还有待进一步深入研究。