缬沙坦对兔动脉成形术后血管内膜增生及内皮细胞ＣＤ３４表达的影响

卢辉和　刘亚军　张　莉　盛臻强　王　毅　管耘园

【摘要】目的观察血管紧张素ⅡⅠ型受体(ATl)拈抗剂缬沙坦对兔动脉成形术后血管内膜增生及内皮细胞CD34表达的影响，探讨ATl受体拮抗剂治疗血管再狭窄的机制和作用。方法雄性新西兰白兔24只，随机分成3组：对照组始终以普通饲料饲养12周，不加任何处理；模型组和缬沙坦给予高胆固醇喂养，4周后行腹主动脉内膜剥脱，继续高胆固醇饮食4周后行球囊成形术，模型组继续普通饲料饲养，而缬沙坦组给普通饲料＋缬沙坦10 nlg·kg^-1·d^-1喂养4周。12周末取腹主动脉行病理形态学观察及CD34免疫组织化学分析。结果与模型组比较，缬沙坦组内膜厚度减少56.58％，内膜面积减少66.81％。免疫组织化学分析显示，缬沙坦组与模型组相比CD34表达增加(P＜0.01)。结论缬沙坦可以减轻兔腹主动脉成形术后内膜增生，其机制可能与促进内膜损伤后的内皮细胞增殖，提高内皮修复功能有关。

【关键词】缬沙坦；血管成形术；再狭窄；CD34；内皮细胞

冠心病介入治疗已成为冠心病治疗的主要手段之一，但术后的再狭窄严重影响了远期疗效。再狭窄形成与血管内皮的修复程度密切相关。内皮细胞损伤的面积决定新生内膜的增厚程度，损伤后内皮层再生速度的快慢对新生内膜增厚程度起着关键作用。内皮在再狭窄中的作用愈来愈成为研究的热点。本研究观察缬沙坦对兔腹主动脉球囊成形术后血管内膜增殖和内皮细胞CD34表达的影响，进一步探讨ATl受体拮抗剂治疗血管再狭窄的机制。

1材料与方法

1．1动脉粥样硬化模型

新西兰大白兔24只(南通大学实验动物中心)，体重(2.0±0.5)kg，随机分成三组，每组8只。对照组始终以普通饲料喂养12周，不加任何处理；模型组和缬沙坦组，予高胆固醇饲料80 g／d，喂养4周后行腹主动脉内膜剥脱。3％戊巴比妥(美国sigma公司)30 mg／kg静脉麻醉，分离切开右侧股动脉，在DSA引导下，插入4F forgarty球囊导管(美国Baxtei Heahhthcare公司)至膈肌处，压力泵注入优维显370充盈球囊(压力400－600 kPa)，缓慢回拉导管到动脉切口处，反复三次，剥脱血管内皮。结扎血管，缝合切口，继续予高胆固醇饮食。

1．2腹主动脉球囊成形术

继续高胆固醇饮食4周后行腹主动脉球囊成形术，3％戊巴比妥30 mg／kg静脉麻醉，分离切开左侧股动脉，在DSA引导下，插入4F forgarty球囊导管，对狭窄部位行血管成型术，反复3次，每次30 s，间隔1 min。结扎血管，缝合切口。模型组继续喂普通饲料，而缬沙坦组普通饲料＋缬沙坦10 mg·kg^-1·d^-1(北京诺华制药)喂养4周。

1．3组织形态学分析

切取所需腹主动脉组织(不超过1 cm)置入10％福尔马林固定液中，固定后行组织修整、洗涤，酒精逐级脱水，二甲苯置换组织块中的酒精，石蜡包埋，蜡块用切片机连续切成厚度4 μm的薄片，HE染色。用LEICA全自动图像分析系统进行图像分析，选择内膜厚度和面积最大处计算血管腔内膜的厚度、面积及中膜的厚度、面积。

1．4免疫组织化学分析

采用SP法测定内膜CD34表达(试剂盒美国Zymed公司)。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。每张切片在LEICA全自动图像分析系统上随机计算5个400倍物镜视野中阳性细胞数(P)及观察细胞总数(A)，求出阳性细胞百分率(P／A，％)。

1．5统计学方法

采用SPSS 10.0分析软件。计量资料以均数±标准差(χ±s)表示，多组间比较采用方差分析(one-way ANOVA)，组问两两比较采用q检验；率的比较采用χ²检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1组织形态学改变

肉眼可见对照组腹主动脉内膜光滑，无斑块形成；模型组管壁有大量黄白色脂样物向管腔凸出，并连成片状；而缬沙坦组斑块明显减少。光镜下，对照组兔腹主动脉内膜为内皮细胞层，内皮下有极少量结缔组织，无平滑肌细胞存在；模型组内膜明显增厚，管腔明显狭窄，内膜内大量泡沫细胞及不定形坏死物质，内膜下出现大量平滑肌细胞增生，平滑肌细胞排列紊乱，为典型的分泌型细胞，细胞问较多的胶原纤维；缬沙坦组内膜也有不同程度的增厚，管腔有所狭窄，较多的中膜平滑肌细胞迁移至内膜下增生，但内膜增生及管腔狭窄程度均较模型组明显减轻。三组动脉内膜、中膜的厚度及形态学改变。

2．2免疫组织化学分析

CD34阳性表达的细胞表现为细胞浆呈棕黄色染色的细胞，对照组、模型组及缬沙坦组的CD34表达分别为(47.01±4.34)％、(68.75±3.00)％、(88.25±2.88)％。缬沙坦组与模型组比较，CD34阳性表达明显增多(P＜0.01)，且缬沙坦组新生内皮细胞排列整齐、完整，而模型组新生内皮细胞排列紊乱、不完整。

3讨论

血管内皮细胞具有许多重要的生理功能，如限制炎症反应、防止血管内凝血系统激活和血栓形成等。结构完整、功能正常的内皮细胞一方面发挥着屏障作用，阻断血管活性物质对平滑肌细胞(SMC)的刺激作用，同時分泌肝素样物质，抑制SMC迁移增殖和分泌。内皮细胞小面积的损伤可以迅速修复，SMC增殖反应轻，可不产生内膜增厚；内皮细胞大面积损伤，内皮细胞难以很快修复，SMC增殖反应明显而持久，可以产生较为严重的内膜增厚和再狭窄。冠心病介入治疗不可避免地损伤内皮细胞，内皮细胞的损伤使分泌抑制SMC增殖的肝素样物质减少，一氧化氮、前列腺环素分泌减少，内皮素分泌增加，同时内皮细胞对血管中层SMC的接触抑制丧失，导致SMC大量增殖，新生内膜增厚，出现再狭窄。大鼠胸主动脉内皮剥脱后的内皮快速修复，尽管仍有SMC的增殖，但内膜的增殖不明显。内皮微小损伤就可引起SMC的移行和增殖，但有内皮覆盖部分不会出现内膜增生。Chandrasekar等和Kipshidze等研究显示，促进损伤部位内皮细胞再生、恢复内膜完整是有效防止再狭窄的关键。

研究表明，ATl受体拮抗剂能够促进血管平滑肌细胞的凋亡，从而减轻血管再狭窄。ATl受体拮抗剂能够改善心肌梗死后血管内皮细胞的功能，但对球囊成形术后血管内皮修复的影响国内未见报道。CD34是相对分子质量为(102～120)×10³、高度酸性的糖基化I型跨膜糖蛋白，属表面分子唾液黏蛋白家族成员之一，主要表达细胞为内皮细胞。因此，本研究采用CD34标记内皮细胞，观察CD34的表达情况，探讨球囊成形术后缬沙坦对血管内膜增生及内皮细胞的影响。结果发现，缬沙坦组较模型组内膜厚度减少56.58％，内膜面积减少66.81％，进一步证实缬沙坦能有效防治球囊扩张成形术后血管的再狭窄。模型组及缬沙坦组的CD34表达分别为68.75％、88.25％，缬沙坦组比模型组CD34阳性表达增多(P＜0.01)，且缬沙坦组新生内皮细胞排列整齐、完整，而模型组新生内皮细胞排列紊乱、不完整。说明血管成形术后，缬沙坦可以促进血管内皮的增生、修复，保持血管内皮的完整性，从而发挥抑制血管的再狭窄作用。这为临床防治血管成形术后再狭窄的治疗提供了一个新的思路，能促进内皮细胞愈合的药物，可以有效地防治再狭窄。有趣的是在研究中观察到缬沙坦组中膜厚度反而较模型组及对照组小，我们推测可能与缬沙坦促进球囊成形术后血管SMC的凋亡有关。

ATl受体拮抗剂能够促进血管SMC的凋亡，但能促进血管内皮细胞的增生。Bernard和Volpe等认为，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)导致类上皮样细胞而非梭形细胞的凋亡，且凋亡由ATl受体而非AT2受体所介导，AnglI介导血管SMC凋亡依赖其类型不同而有所差异，因而导致ATI受体拮抗剂对血管内皮细胞及血管SMC产生相反的作用。血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)特异地表达于血管内皮细胞上，是血管内皮细胞分化、增殖的信号传导的关键受体。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B(PI 3K／Akt)是抗细胞凋亡的重要途径，Akt能在转录水平调节促存活和抗凋亡基因的表达，介导细胞因子和生长因子引起的细胞增殖、凋亡和存活。Watanabe等和Grothusen等研究发现，ATl受体拮抗剂氯沙坦的代谢产物EXP3179通过活化VEGFR-2／PI 3K／Akt途径，促进一氧化氮合成酶(eNOS)的磷酸化，抑制导致内皮细胞死亡的肿瘤坏死因子．a(TNF-a)，从而促进血管内皮的增生、改善内皮的功能。缬沙坦促进血管内皮的增生、保持内皮增生后的完整性机制目前还不完全清楚，有待于进一步研究。