丹参对“二次打击”急性肺损伤大鼠的保护作用

吴丽娟　黄小民　何煜舟　汪云开

【摘要】目的探讨丹参注射液对“二次打击”急性肺损伤(ALI)大鼠的干预作用及可能的机制。方法Wister大鼠30只，随机分为正常对照组、模型组、丹参干预组。采用“二次打击”法复制大鼠急性肺损伤模型：以油酸(OA)0.2 ml／kg从尾静脉注入，4 h后，脂多糖(LPS)2 mg／kg从另一尾静脉注入。显微镜下观察病理，测肺湿／干比重(W／D)，测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量及中性粒细胞比例，计算肺通透指数(LPI)以评价肺损伤程度。免疫组化法检测肺组织Fas，FasL蛋白表达，原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肺组织细胞凋亡。结果“二次打击”法可成功复制出急性肺损伤大鼠模型。实验中丹参干预组大鼠肺组织大体及病理损伤程度均明显轻于模型组，同时W／D，及BALF中中性粒细胞比例，肺通透指数亦较模型组明显减轻。免疫组化结果显示模型组Fas，FasL的表达明显高于其余两组(P＜0.01)，TUNEL示模型组细胞凋亡指数明显高于其余两组(P＜0.01)。Fas，FasL蛋白表达强度与凋亡指数呈正相关。结论丹参注射液对“二次打击”所致急性肺损伤有保护作用。其机制可能与Fas，FasL表达减少，抑制肺组织细胞凋亡有关。

【关键词】二次打击；急性肺损伤；丹参；细胞凋亡；FasFasL

急性肺损伤(ALI)是呼吸系统常见的急重症之一，有较高的病死率。它是机体遭受严重感染、创伤、休克、酸中毒等各种因素打击，出现的以弥漫性肺泡毛细血管膜损伤导致的肺水肿和微肺不张为病理特征的一种肺部炎症和通透性增加的综合征，目前认为是机体过度炎症反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛破坏的结果。而细胞凋亡在这一过程中起了重要的作用。本实验通过“二次打击”造成大鼠ALl模型，观察大鼠肺组织细胞凋亡与Fas，FasL蛋白的表达变化，探讨丹参注射液对ALl大鼠的保护作用。

1材料与方法

1．1材料

Wister大鼠30只，雌性，体重(180±10)g(浙江中医药大学实验动物中心提供)。油酸(OA)，化学纯，购自华东医药公司，生产批号20060215。脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品。丹参注射液，规格10 ml，每10 ml含生药7.5 g，正大青春宝药业有限公司生产，生产批号20060820。细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ CellApoptosis Detection Kit I，POD)为德国ROCHE公司产品。兔抗鼠Fas多克隆抗体，兔抗鼠FasL多克隆抗体，免疫组化SAC试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。蛋白定量试剂盒(考马斯亮蓝法)为南京建成生物工程研究所产品。

1．2方法

1．2．1分组将健康雌性Wister大鼠随机分为对照组、模型组、丹参干预组，每组10只。

1．2．2大鼠急性肺损伤模型的建立模型组以30 g／L戊巴比妥40 mg／kg腹腔麻醉OA 0.2 ml／kg从尾静脉注入，4 h后，LPS 2 mg／kg从另一尾静脉注入。正常对照组分别以同等剂量生理盐水代替OA和LPS，丹参干预组在给予OA前1 h，腹腔注射给予丹参注射液12 ml／kg。各组动物在第二次打击后2 h处死。

1．2．3观察指标

1．2．3．1肺组织损伤指标的测定将动物剖腹，下腔静脉取血处死大鼠。留取抗凝血以待测血浆蛋白含量。开胸，暴露气管，通过气管上端的小切口插入灌胃针结扎固定，用丝线结扎右肺，分别用3ml生理盐水灌洗左肺3次，合并3次收集到的支气管肺泡灌洗液(BALF)，回收率80％～90％。BALF经双层纱布过滤，以3000 r／min离心10 min，取上清液-20℃冻存待测蛋白含量，取沉淀细胞悬液一滴于玻片上行Wright染色，计数200个细胞得出中性粒细胞的百分比。考马斯亮蓝法测定BALF中蛋白含量，全自动生化分析仪测定血浆蛋白含量，计算肺通透指数(LPI=BALF蛋白／血浆蛋白)。肺门处结扎去下右肺，取右上肺用滤纸吸血，称湿重后，置烤箱中(80℃，48 h)烤至恒重，称干重，计算肺湿／干比重。

1．2．3．2肺组织学检查右下叶经40 g／L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红(HE)染色，光镜下进行组织形态学观察。

1．2．3．3肺组织细胞凋亡原位检测采用TUNEL法，按照细胞凋亡原位检测试剂盒(in situ CellDeath Detection Kit，POD)提供方法进行。计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数，凋亡指数以凋亡细胞／100个细胞表示。

1．2．3．4肺组织细胞的Fas、FasL蛋白的免疫組化染色步骤参照试剂盒推荐方法进行。阴性对照采用0.01 mmol／L PBS代替一抗。结果判断：每张切片选取5个具有代表性的视野，计数其中阳性细胞数，结果取5个视野的平均值。

1．3统计学方法

采用SPSS 11.5软件进行分析，计量资料以均数±标准差(χ±s)表示，组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。双变量相关分析采用Bivariate过程的Pearson等级相关法分析。

2结果

2．1病理组织学观察

正常对照组大鼠肺表面呈淡红色，光镜下可见组织结构清晰，肺泡腔内无渗出物，间质无明显炎性细胞浸润，肺泡壁无增厚，而模型组大鼠肺表面呈暗红色，伴明显渗出，光镜下肺泡壁增厚，间质弥漫性出血，并有大量炎性细胞浸润，可见局灶性肺不张、肺泡结构破坏，肺气肿形成。应用丹参干预后，损伤大鼠肺表面渗出不明显，光镜下肺泡壁的增厚较模型组明显减轻，间质仅见少量炎性细胞浸润。

2．2肺损伤指标的变化

二次打击后，模型组BALF中性粒细胞比例、肺通透指数及肺湿／干比重均明显高于正常对照组(P＜0.01)，表明二次打击法成功复制急性肺损伤模型。丹干预组与模型组相比，BALF中性粒细胞比例、肺通透指数及肺湿／干比重均明显下降(P＜0.01)，可见丹参注射液可减轻急性肺损伤的程度。

2．3TUNEL法检测肺组织细胞凋亡

TUNEL染色阳性以肺泡上皮细胞和血管内皮细胞、支气管上皮细胞为主，凋亡细胞核呈棕色，核固缩，个别细胞可见凋亡小体。模型组凋亡指数明显高于正常对照组(P＜0.01)，丹参干预组凋亡指数与模型组比较则明显下降(P＜0.01)，与正常对较组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2．4肺组织Fas，FasL蛋白表达

Fas，FasL阳性细胞表现为细胞浆和细胞膜棕黄色染色，主要分布于支气管黏膜上皮，肺泡上皮，及部分炎性细胞。正常对照组可见少量阳性表

达，模型组Fas FasL蛋白明显上调，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)，丹参干预组阳性表达较模型组明显减少(P＜0.01)。

2．5相关性分析

將3组大鼠的肺组织细胞凋亡率与Fas，FasL蛋白表达作相关性分析，发现两者有显著的正相关性(r=0.849，0.853，P＜0.05)，差异具有统计学意义。

3讨论

ALl是目前临床危重症研究的热点之一，但是其发病机制复杂，使得模拟ALl的诱发因素、发病过程等显得很困难。既往的研究多集中于内毒素、机械通气损伤、油酸、缺血一再灌注、气体吸入等所诱导的模型，与临床上ALI的发病过程有一定差距。本实验采用“OA＋LPS”二次打击法复制ALl模型。所谓二次打击，第一次打击(严重感染或创伤等)激发引起机体SIRS，在此基础上第二次打击(创伤后感染，不恰当复苏等)引发SIRS失控导致ALI。本模型更好的模拟了临床ALI发展的病理生理过程。本实验采用OA致伤后4 h，以小剂量LPS实施第二次打击，2 h后出现BALF中中性粒细胞比例增加，肺湿／干比重，肺通透指数增高，肺组织病理可见肺泡壁增厚，腔内见渗出、出血等，间质炎性细胞浸润，表现为肺组织急性损伤，成功地复制了“二次打击”急性肺损伤模型。

本实验采用TUNEL法检测肺组织细胞凋亡，发现模型组凋亡指数明显增高，表明细胞凋亡在“二次打击”急性肺损伤中起一定作用，其机制可能有：通过肺泡上皮和血管内皮细胞的凋亡导致肺血管内皮-上皮屏障通透性增加，液体、蛋白等渗漏到肺泡间质及肺泡腔内，导致气体交换障碍；通过巨噬细胞的凋亡，使其吞噬能力下降，使得凋亡的中性粒细胞无法被及时吞噬清除，其有毒内容物释放进一步损害肺泡壁等。

Fas，FasL系统是细胞凋亡的重要信号转导通路。Fas是一种细胞表面受体，为Ⅰ型跨膜蛋白，与肿瘤因子坏死受体和神经因子生长受体高度同源，FasL是Fas的天然配体，属Ⅱ型跨膜蛋白，FasL与Fas结合后启动凋亡信号转导从而导致细胞死亡。本实验发现模型组Fas，FasL蛋白表达明显高于正常对照组和丹参干预组(P＜0.01)，并且Fas，FasL蛋白表达强度与凋亡指数呈正相关。提示Fas，FasL活化可能是“二次打击”ALl的发生机制之一。

丹参是传统的中草药，祖国医学认为丹参具有活血化瘀的作用。其主要成分为丹参酮和丹参素，研究表明其具有抗氧化、清除氧自由基、改善微循环、拮抗钙离子及抗炎等多种作用。本实验显示“二次打击”ALI大鼠采用丹参干预后，肺系数、肺通透指数，BALF中中性粒细胞比例等反映肺损伤的指标较模型组明显改善，证明丹参对ALI大鼠具有一定的保护作用。同时，丹参干预组大鼠肺组织细胞凋亡明显受抑制，Fas，FasL蛋白的表达也下调，提示丹参对ALl大鼠的保护作用可能与Fas，FasL下调，抑制肺组织细胞凋亡有关。Morimoto等的研究表明活性氧可能对Fas，FasL系统的表达有上调作用，给予抗氧化剂可阻断其介导的细胞凋亡。笔者推测丹参对Fas，FasL表达影响可能与其抗氧化，清除氧自由基的作用有关，但具体机制仍有待于进一步研究。