海滨猫尾木叶绿体基因组特征及编码基因psbB对冷胁迫的响应

摘 要： "低温是濒危红树植物海滨猫尾木（Dolichandrone spathacea）生态修复的重要障碍，植物叶绿体及其编码的基因密切响应冷胁迫，解析叶绿体基因组特征及冷胁迫下编码基因psbB的分子响应规律有助于该物种的保护与修复。为揭示叶绿体基因组信息，该研究通过Illumina NovaSeq测序平台对海滨猫尾木总DNA进行测序、组装、注释和功能分析，以及为探究冷胁迫下psbB基因的变化规律，并且检测了海滨猫尾木幼苗在不同温度处理下的总叶绿素、丙二醛、脯氨酸、总酚、可溶性蛋白和可溶性糖等生理参数，同时利用荧光定量PCR实验检测了相应处理下叶片psbB基因的表达水平。结果表明：（1）海滨猫尾木叶绿体具有典型四分体结构，基因组大小为159 139 bp，GC含量为37.9%，编码133个基因。其中，包括蛋白质编码基因（88个），tRNA基因（37个）和rRNA基因（8个）。（2）在系统发育分析中，海滨猫尾木未能形成单系，同其他8种紫葳科植物聚为一束，支持率达100%。（3）冷胁迫下，海滨猫尾木幼苗叶片总叶绿素含量随着处理温度的降低呈下降趋势，而总酚、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量以及叶绿体编码基因psbB的相对表达量均随着处理温度的降低呈上升趋势。综上认为，海滨猫尾木叶绿体基因组特征与其他紫葳科植物高度保守。在冷胁迫下，该植物总叶绿素合成受到抑制，渗透性调节物质的合成受到影响，同时编码基因psbB参与了植物冷胁迫下的分子调控。以上结果为提升濒危红树植物抗冷能力分子辅助育种提供了前期基础。

关键词： 海滨猫尾木， 叶绿体基因组， 系统发育分析， 冷胁迫， 生理指标， psbB基因

中图分类号： "Q943

文献标识码： "A

文章编号： "1000-3142（2025）01-0058-11

基金项目： "海南省重点研发计划项目（ZDYF2021SHFZ259）； 湛江市科技计划项目（2022A05013）； 海南省院士创新平台科研专项（YSPTZX2022011）。

第一作者： 廖晓童（2002—），研究方向为濒危红树植物种质资源保护，（E-mail） 769426376@qq.com。

*通信作者： "张颖，博士，教授，硕士生导师，从事濒危红树植物种质资源保护，（E-mail） Zhangyingred@lingnan.edu.cn。

Characteristics of chloroplast genome and response of

psbB

gene of Dolichandrone spathacea under cold stress

LIAO Xiaotong"ZHANG Taimin"LI Weijin"LI Danfeng"YANG Yong²，

CHEN Guangcheng"ZHANG Ying^1*

（ 1. Life Science and Technology College， Key Laboratory of Conservation and Restoration of Mangrove Ecosystem， Engineering and Technological

Research in Protection and Utilization of Mangrove Rare and Endangered Species， Lingnan Normal University， Zhanjiang 524048， Guangdong，

China; 2. College of Life Sciences， Ministry of Education Key Laboratory for Ecology of Tropical Islands， Key Laboratory of

Tropical Animal and Plant Ecology of Hainan Province， Hainan Normal University， Haikou 571158， China ）

Abstract： "Low temperature is an important obstacle to the ecological restoration of endangered mangrove plant Dolichandrone spathacea. Plant chloroplasts and their coding genes closely respond to cold stress. Analyzing chloroplast genome characteristics and understanding the molecular response patterns of psbB genes under cold stress can help protect and restore this species. To reveal the chloroplast genome information， this study sequenced the total DNA of D. spathacea using the Illumina NovaSeq sequencing platform， and then annotated and functionally analyzed the assembled chloroplast genome. In the meantime， the changes of psbB gene in D. spathacea seedlings under different temperatures were investigated， and physiological parameters such as total chlorophyll， malondialdehyde， proline， total phenols， soluble protein， and soluble sugar were detected in this study. Further the expression value of psbB gene was detected using fluorescence quantitative PCR experiment. The results were as follows： （1） The chloroplast genome of D. spathacea exhibited a typical tetrad structure with the length of 159 139 bp， and the "GC content of 37.9%. It encoded a total of 133 genes， including protein-coding genes （88）， tRNA genes （37） and rRNA genes （8）. （2） Phylogenetic analysis revealed that D. spathacea did not form a monophyletic group but instead clustered with 8 other Bignoniaceae species， with a support rate of 100%. （3） Under cold stress， the contents of total chlorophyll in the leaves of the D. spathacea seedlings decreased with the decrease of treatment temperature， while the contents of total phenols， malondialdehyde， proline， soluble protein and soluble sugar and "relative expression values of psbB gene in the seedling leaves increased with the decrease of treatment temperature. In summary， the chloroplast genome characteristic of D. spathacea is highly conservative in Bignoniaceae family. Under cold stress， the total chlorophyll synthesis of the plant is inhibited， and the synthesis of osmoregulatory substances is affected. At the same time， the psbB gene is involved in molecular regulation under plant cold stress. The above results provide a preliminary basis for molecular assisted breeding to improve the cold resistance of endangered mangrove plants.

Key words： Dolichandrone spathacea， chloroplast genome， phylogenesis analysis， cold stress， physiological indicators， psbB gene

海滨猫尾木（Dolichandrone spathacea）隶属于紫葳科（Bignoniaceae）猫尾木属（Dolichandrone），是我国典型的半红树植物（胡启明等，1987）。其自然分布于海南和广东两省，2006年被列入《海南省重点保护野生植物名录》（张颖等，2021）。该植物拥有重要的生态和药用价值（田广红等，2011）。作为中国和东南亚地区传统的药用植物，海滨猫尾木在医疗上已被用作治疗糖尿病、癌症和其他疾病的药物（Akashi amp; Gojobort， 2002）。但是，海滨猫尾木的濒危状态限制了其生态价值和药用价值的深入利用。红树植物通常生长在热带和亚热带的海岸潮间带。然而，近年来频繁发生的低温灾害，给包括海滨猫尾木在内的红树植物带来了短期、突然的低温伤害（黄雪松，2021），增加了其生态修复工作的难度。

温度是影响植物生长发育的重要影响因子（Wang XP et al.， 2022），低温胁迫会对植物叶绿体结构、光合色素含量产生影响（Li WJ et al.， 2022）。叶绿体拥有相对独立的遗传体系（邢少辰和Clarke，2008）是植物特有的细胞器，对植物的生长发育起着重要作用（Llorente et al.， 2021）。在植物分类与物种水平的系统发育等研究中，叶绿体基因组由于大小适中，编码区序列相对保守，结构比较稳定，进化速率相对较低等优点而受到重视（Xu et al.， 2001）。随着测序技术的快速发展，已公布了超过1 000种高等植物的叶绿体基因组全序列（Liu et al.， 2022）。其中，对紫葳科多种植物的叶绿体基因组特征进行了全面分析和报道（Nazareno et al.， 2015; Thode amp; Lohmann， 2019; Yaradua amp; Yessoufou， 2022; Li F et al.， 2022），但目前尚未发现有关海滨猫尾木的相关研究报道。

叶绿体编码基因psbB属光系统Ⅱ相关基因，在叶绿体发育中起着关键的作用。在受到逆境胁迫，如在高温和干旱（Bi et al.， 2016）及盐胁迫下（Sehar et al.， 2021）植物叶片中基因psbB的表达显著升高，在重金属胁迫下受到抑制（Li et al.， 2020），但在冷胁迫下该基因的表现如何鲜见报道。因此，本研究组装、注释获得了海滨猫尾木完整叶绿体基因组并进行了特征分析。对海滨猫尾木幼苗进行冷胁迫处理，分析生理指标和叶绿体编码基因psbB的表达特征，拟探讨以下问题：（1）海滨猫尾木叶绿体基因组的结构特征；（2）海滨猫尾木幼苗在冷胁迫下的生理响应；（3）冷胁迫下叶绿体编码基因psbB的表达特征。以期为揭示该植物冷胁迫分子响应机制补充内容。

1 材料与方法

1.1 实验材料

海滨猫尾木种子采自中国海南岛的三亚铁炉港（109°32′50″ E、18°14′26″ N）且健康、无虫害植株，同时在海南师范大学标本室保存相应标本（DC-001）。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取与测序 先将种子在清水中浸泡24 h，再植入含60% 沙+40% 土壤培养基的塑料箱（20 cm × 30 cm）中，最后移入苗木培育室（光照14 h，黑暗10 h，湿度60%～80%，温度25～28 ℃）进行培育。待4～6片叶时，采集幼嫩叶片，DNA提取试剂盒（TransGen，中国）提取基因组DNA。并在Illumina HiSeq平台（杭州惠通生物技术有限公司）进行末端150 bp读数测序。

1.2.2 叶绿体全基因组序列组装、注释及图谱绘制 通过Fastqc软件评估原始测序数据质量。利用在线注释工具DOGMA（Wyman et al.， 2004）对叶绿体基因组进行注释。通过ORF预测以及NR数据库比对，确定注释结果（尚明越等，2023）。用OGDRAW软件绘图（Greiner et al.， 2019）。

1.2.3 系统发育分析 以拟南芥（Arabidopsis thaliana）和狭叶恋岩花（Echinacanthus attenuatus）作为外类群，从GenBank数据库下载8种紫葳科植物楔叶杯领藤（Amphilophium cuneifolium）、黄葳（Anemopaegma chamberlaynii）、鹰爪滕（Dolichandra cynanchoides）、Tanaecium tetragonolobum、Adenoca-lymma aurantiacum、Neojobertia candolleana、白花母兰（Pleonotoma albiflora）、硬骨凌霄（Tecoma capensis）的叶绿体基因组序列。提取11种植物叶绿体基因组45个共有CDS核苷酸序列，用MAFFT（v. 7）（Katoh amp; Standley， 2013）软件进行序列比对，分析结果用MEGA 11（Koichiro et al.， 2021）软件构建最大似然（maximum likelihood，ML）树。

1.2.4 冷胁迫实验及生理指标的测定 待1.2.1培育的幼苗长到8～10片叶时，进行不同温度胁迫处理，每个处理时长48 h，温度梯度为28 ℃/25 ℃（CK）、15 ℃/12 ℃（T1）、10 ℃/5 ℃（T2）和恢复15 ℃/12 ℃（T3，其中温度模式为光照/黑暗），每个处理5株植物。采集幼苗倒数2～3对叶测量生理指标，总叶绿素由上海科艾博生物植物总叶绿素ELISA检测试剂盒测定，丙二醛、脯氨酸、总酚和可溶性糖由北京索莱宝科技有限公司相应微量法试剂盒提取，可溶性蛋白用北京索莱宝科技有限公司植物蛋白试剂盒提取，再用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.2.5 基因psbB在冷胁迫植株中的表达"使用诺维赞公司试剂盒（FastPure plant Total RNA Isolation Kit）提取海滨猫尾木叶片总RNA。cDNA由Takara 公司（PrimeScript TM FAST RT）试剂盒合成。根据psbB基因序列使用Primer 6.0软件设计引物如下：上游引物psbB-F为5′-AGAGATAAAGAAGGGCGTGAGC-3′，下游引物psbB-R为5′-CCATTGAGTTCGCCGCCAT-3′；内参基因为拟南芥U6基因，上游引物"U6-F为5′-ACATCCGATAAAATTGGAACGA-3′，下游引物U6-R：5′-TTTTTTTGGACCATTTCTCGAT-3′。根据北京全式金Perfectstart Green qPCR试剂盒说明书三步法进行荧光定量PCR验证实验，方法如下：94 ℃ 30 s，1个循环；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环；反应体系20 μL。

2 结果与分析

2.1 叶绿体基因组结构特征

如图1所示的海滨猫尾木叶绿体基因组四分体结构，全长159 139 bp，GC 含量37.9%，AT含量62.1%，具有明显的AT偏向性。2个大小相同、方向相反的反向重复区（inverse repeats，IRs）分隔出大单拷贝区（large single copy，LSC） 和小单拷贝区（small single copy，SSC），IRs、LSC、SSC长度分别为30 234 、86 036、12 635 bp。

2.2 叶绿体基因组功能及分类

共有133个基因被注释到该叶绿体基因组中，包括蛋白编码基因（88个）、rRNA基因（8个）和tRNA基因（37个），根据功能注释基因可分为4大类（表1）。在这些基因中，有6个蛋白质编码基因、9个tRNA编码基因和4个 rRNA编码基因位于IR区。18个基因具有内含子，其中基因rps12、clpP、ycf3含有"2个内含子（表 1）。

2.3 系统发育分析

为确定海滨猫尾木的系统发育位置，以狭叶恋岩花和拟南芥为外类群，结合已公布的8种紫葳科植物，共计11个叶绿体基因组序列进行分析（图2），显示9个紫葳科植物构成一个单系分支，显著区分于外类群，具有100%支持率。海滨猫尾木与光梓藤属植物Neojobertia candolleana、白花母兰以及硬骨凌霄的亲缘关系最近，但未聚为一支，支持率为100%。

2.4 冷胁迫对海滨猫尾木的影响

2.4.1 冷胁迫对植物表型的影响 由图3可知，28 ℃/25 ℃（CK）处理后的海滨猫尾木幼苗株型健康挺拔，叶色浓绿，生长状态最佳；15 ℃/12 ℃（T1）处理48 h后，叶色转黄，部分植株叶片出现轻度萎蔫；10 ℃/5 ℃（T2）处理48 h时后所有植株叶片严重萎蔫；但经过15 ℃/12 ℃（T3）恢复培养48 h后，植株表现不同程度的恢复。

2.4.2 低温胁迫对生理指标的影响

由图4可知，海滨猫尾木幼苗叶片的总叶绿素含量随着处理温度的降低呈下降趋势，在T2时达到最低值，经过T3（15 ℃/12 ℃恢复培养48 h）时，总叶绿素含量显著升高；渗透性调节物质总酚、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量均随着处理温度的降低呈上升趋势，当温度在T2时达到最大值，在T3时显著下降，但可溶性蛋白含量除外。

2.4.3 基因psbB在冷胁迫植株中的表达"由图5可知，叶绿体编码基因psbB的相对表达量在冷胁迫下随着温度降低呈上升趋势，当植株经历T2温度处理后再进行T3温度恢复培养时，基因psbB的相对表达量显著下降但仍高于第一次15 ℃/12 ℃（T1）处理时的相对表达量。

3 讨论

3.1 叶绿体基因组序列特征

叶绿体基因组是可以独立于核基因组外进行遗传的一套基因组，有遗传多样性和单亲遗传限制以及异交重组等特点，近年来成为植物系统发育研究、药用植物驯化、改良和基因工程的重要对象（Gao et al.， 2022；郭冉昊等，2023）。海滨猫尾木叶绿体基因组是第一个被揭示的紫葳科红树植物叶绿体基因组。高等植物叶绿体基因组长度通常在120～180 kp间，编码基因一般为100～130个，其中编码蛋白质基因可达80 ～ 88个（Zhang et al.， 2019）。海滨猫尾木叶绿体基因组的长度、编码基因数目和种类与其他紫葳科植物的研究结果一致，符合叶绿体基因组高度保守的特性（Nazareno et al.， 2015; Thode amp; Lohmann， 2019; Yaradua amp; Lessoufou， 2022; Li F et al.， 2022）。通过共有 CDSs构建系统发育树，海滨猫尾木与其他紫葳科植物聚为一枝，此结果与经典分类结果相同（胡启明等，1987），说明叶绿体基因组可以提供比传统分子标记更多的信息，能够提供更高分辨率的遗传分析，成为传统植物分类的有力支撑（Zhang et al.， 2023）。

3.2 海滨猫尾木在冷胁迫下的生理响应

叶绿素作为光合作用的基础可以反映植物整体的光合速率，而光合速率是反映植物抗逆性以及生长状况的重要因素（冯峻等，2024），低温胁迫的加剧会导致最大净光合速率及光饱和点下降（武辉等，2014），因此叶绿素含量变化可以一定程度反映植物的抗逆性情况。在冷胁迫下叶绿素合成受到抑制，同时分解速度加快，光合速率下降导致光合作用变弱（任延靖等，2020）。本研究发现，海滨猫尾木幼苗在冷胁迫下，随着温度的降低，叶绿素含量随之下降，当温度回升时，叶绿素含量随之回升，这也表明短时间（48 h内）的冷害对红树植物的伤害可以恢复，这一发现对该濒危红树植物的迁地保护具有指导意义。

冷胁迫会使植物细胞膜受到破坏，从而使膜脂过氧化而产生脯氨酸，同时产生的丙二醛含量越高，膜脂过氧化程度加剧（安孝莹等，2024）。丙二醛具有细胞毒性，本研究发现冷胁迫程度越剧烈，丙二醛含量就越高，与柏科植物随着逆境胁迫程度的加深，丙二醛含量的变化趋势一致（姚红，2013）。受到冷胁迫时，植物体内脯氨酸会增加，以减轻细胞所受侵害（Wang J et al.， 2022）。脯氨酸可以增强植物抗逆性，起到清除自由基、保护酶和细胞结构以及调节胞质渗透压的作用（Zhu et al.， 2024）。在冷胁迫下，海滨猫尾木植株叶片脯氨酸含量呈上升趋势，随着温度的回升脯氨酸含量下降，这与茶树受低温胁迫后脯氨酸含量的变化趋势相同（薄晓培等，2016），说明起源于热带的植物拥有相似的通过调节脯氨酸含量来促进植物冷胁迫适应的能力。可溶性糖、可溶性蛋白与植物细胞的渗透压浓度成正相关，与水势成负相关，较高浓度的可溶性糖和可溶性蛋白能降低植物受冷害的程度（Ren et al.， 2023）。海滨猫尾木叶片中的可溶性糖和可溶性蛋白含量随着温度的降低而呈上升趋势，与3种护坡植物的研究结果一致（何云等，2012），可溶性蛋白含量的变化趋势与澳洲坚果（Macadamia integrifolia）的研究结果一致（岳海等，2010），以上植物表现出相似的温度适应调控机制。海滨猫尾木对一定程度的冷胁迫有较好的适应能力，这可能也是该濒危红树植物能够在温度低于原生地的珠海淇澳岛红树林湿地迁地保护成功的内部原因（田广红等，2011）。

3.3 海滨猫尾木在冷胁迫下叶绿体基因组编码基因的响应

叶绿体基因组编码的光合系统基因、自我复制基因、生物合成基因等功能基因在植物适应温度变化中起着重要作用，而这些基因的表达在冷胁迫下发生了改变。转录组分析显示，紫花苜蓿（Medicago sativa）冷敏感品种中tRNA基因显著上调，rps7、rpl32和ndhB基因下调，耐寒品种中叶绿体编辑基因ycf1、ycf2和ndhF的编辑效率降低，这可能与叶绿体通过光合作用储存养分来抵御寒冷有关（Zhang et al.， 2024）。海滨猫尾木叶片中基因psbB的表达量随着冷胁迫程度的加深而上调，同是热带植物的油茶（Camellia oleifera）基因psbS的表达量也有类似的表现（Wu et al.， 2020）。说明基因psbB在海滨猫尾木冷胁迫响应中起到较为重要的作用，该基因有望被应用到该物种提升抗冷能力的分子辅助育种工作中。

4 结论

海滨猫尾木叶绿体基因组特征在紫葳科植物中高度保守。生理响应实验表明，冷胁迫会抑制海滨猫尾木总叶绿素的合成，促进渗透调节物质总酚、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的增加，促进毒性物质丙二醛含量的增多。通过荧光定量PCR实验发现，海滨猫尾木叶片中叶绿体编码基因psbB的相对表达量会随着冷胁迫程度的加深而升高。以上研究结果可为科学制定海滨猫尾木叶绿体基因工程选育耐冷植物材料提供前期支撑。

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（责任编辑 周翠鸣）