气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定发酵食品中5种N-亚硝胺类化合物

摘 要：目的：建立气相色谱-三重四极杆串联质谱测定发酵食品中5种N-亚硝胺类化合物的分析方法。方法：样品经椰壳活性炭固相萃取小柱净化富集，采用大体积程序升温进样，经DB-1701色谱柱分离，采用多反应监测模式进行测定，以质量数和保留时间定性，内标法定量。结果：5种N-亚硝胺类化合物的浓度在25～1 000 μg·L-1线性关系良好，相关系数均大于0.996 0；方法检出限在0.1～0.8 μg·kg-1，定量限在0.3～

2.8 μg·kg-1；样品的加标回收率为76.2%～112.1%，相对标准偏差在2.1%～8.1%。结论：该方法准确、可靠，适用于发酵食品酱油、黄酒中5种N-亚硝胺类化合物的检测。

关键词：N-亚硝胺；发酵食品；气相色谱-三重四极杆串联质谱法

Determination of 5 N-Nitrosamine Compounds in Fermented Foods by Gas Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry

MA Jiajun， FU Chunhui， YANG Rui， PING Tianmin， FU Huajing， LIU Zhen*

（Shaoxing Testing Institute of Food and Drug， Shaoxing 312000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of 5 N-nitrosamines in fermented food by gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. Method： The samples were purified and concentrated by a small column of solid phase extraction of coconut shell activated carbon， injected with a large volume temperature program， separated by DB-1701 chromatographic column， determined by multiple reaction monitoring mode， qualitative by mass number and retention time， quantitative by internal standard method. Result： The concentration of 5 N-nitrosamines was in the range of 25 μg·L-1 to 1 000 μg·L-1， and the correlation coefficient was greater than 0.996 0. The limits of detection and quantitation were 0.1 μg·kg-1 to 0.8 μg·kg-1 and 0.3 μg·kg-1 to

2.8 μg·kg-1. The recoveries ranged from 76.2% to 112.1%， and the relative standard deviation was 2.1% to 8.1%. Conclusion： The method is accurate and reliable， and is suitable for the determination of 5 N-nitrosamines in fermented food soy sauce and rice wine.

Keywords： N-nitrosamine; fermented food; gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry

在一定条件下，食品中亚硝酸盐与胺类化合物发生亚硝基化作用生成N-亚硝胺[1]。N-亚硝胺具有强烈的致癌性，可对人体健康造成巨大威胁。因此，对食品与环境中N-亚硝胺污染水平的把控与监测十分必要[2-5]。

食品是人体摄入N-亚硝胺的主要来源，目前食品中N-亚硝胺检测研究采用的方法包括气相色谱-热能分析法（Gas Chromatography-Thermal Energy Analysis，

GC-TEA）、气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography-

Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）[6]及高效液相色谱-串联质谱法（High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）[7-8]等。

热能分析法对亚硝胺具有高度特异性，但仅局限于亚硝基化合物的分析，且价格昂贵，在推广应用上存在局限[9]。质谱法利用碎片分析可以定性，色谱-质谱联用技术结合了色谱高效的分离能力、质谱法精准确定分子量和分子结构的能力，在分析和鉴定复杂多组分有机混合物上应用广泛。然而，HPLC-MS/MS对低质量数N-亚硝胺存在响应不足的问题。近年来，随着三重四极杆质谱联用仪的发展，GC-MS/MS已逐渐成为N-亚硝胺分析的常规检测手段，采用多反应监测模式扫描，具有选择性好、定性特异性强、定量准确度高的优点[10-12]。

程序升温大体积进样技术（Programmed Temperature

Vaporization，PTV），基于GC-MS技术发展而来，其核心机制在于利用低温进样口蒸发样品中的大部分溶剂，保留低挥发性的微量目标物，再通过程序化升温使这些物质蒸发，进而进入色谱柱进行分析[13]。传统的毛细管气相色谱的柱容量较小，仅能接受微升级（一般在1 μL左右）的进样量。大体积进样可将进样量增加100倍或更多，提高了检测效率和分析灵敏度[14]。李登昆等[15]将大体积程序升温进样应用于饮用水中3种挥发性N-亚硝胺的测定，研究发现大体积程序升温气化进样可通过增加进样量来提高方法的灵敏度。

目前，关于发酵食品（黄酒、酱油）中N-亚硝胺检测的研究较少[16]。黄酒和酱油是我国的传统发酵食品，在发酵过程中，蛋白质会代谢生成胺类化合物，在适宜条件下可能生成亚硝胺[17]。因此，建立准确灵敏快速的黄酒和酱油中N-亚硝胺的检测方法，有助于识别和预警食品安全隐患。本研究将固相萃取技术（Solid Phase Extraction，SPE）和QuEChERS法引入发酵食品黄酒和酱油N-亚硝胺检测的前处理当中，实现复杂基质的有效净化及N-亚硝胺化合物的高效富集，使用PTV进样模式，采用高选择性、高灵敏度的GC-MS/MS仪器，建立同时测定多种N-亚硝胺的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TQ8040NX气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配备PTV进样口）（日本岛津公司）；ME204E精密电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；N-EVAP-24氮吹仪（美国Organomation公司）；Fotector 08HT高通量全自动固相萃取仪（睿科集团有限公司）；Centrifuge 5920R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

PSA QuEChERS专用超洁净填料（40～63 μm）、GCB石墨化碳黑（120～400目）、椰壳活性炭固相萃取小柱（1 g，6 mL）。二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇及丙酮（均为色谱纯）；无水硫酸钠（分析纯）；氯化钠（分析纯）。

N-二甲基亚硝胺（NDMA）、N-甲基乙基亚硝胺（NMEA）、N-二乙基亚硝胺（NDEA）、N-二丙基亚硝胺（NDPA）、N-亚硝基吗啉（NMOR）等N-亚硝胺混合标准品（浓度为2 000 mg·L-1，上海安谱实验科技股份有限公司）；氘代N-二甲基亚硝胺内标物（NDMA-d6，纯度为98.6%，北京曼哈格生物科技有限公司）；氘代N-二丙基亚硝胺内标物（NDPA-d14，浓度为1 008 mg·L-1，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器条件

（1）色谱条件。PTV进样量：10 μL；进样温度：起始温度50 ℃，保持1 min，以250 ℃·min-1升温至250 ℃，保持8 min；普通进样量：2 μL；色谱柱：DB-1701（30 m×250 μm，0.25 μm）；柱温：起始温度为40 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1升温至100 ℃，以20 ℃·min-1至250 ℃，保持2 min；载气：氦气，流速为1.5 mL·min-1。

（2）质谱条件。离子源：EI；采集模式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；接口温度：280 ℃。

1.2.2 样品处理

（1）QuEChERS法。取样品50 g，加入内标标准溶液，混匀，加入10 g氯化钠，加入50 mL有机萃取溶剂震荡萃取，静置分层，如出现乳化现象可将乳化层于6 000 r·min-1离心2 min，分出有机相并加入QuEChERS净化试剂，涡旋3 min，离心取上清液，于35 ℃以下缓慢氮吹浓缩至5 mL，经少量无水硫酸钠干燥后进样。

（2）固相萃取法。椰壳活性炭固相萃取小柱依次用5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL水活化，取

50 g已加内标样品上样，重力作用自然流下，用5 mL

水淋洗，抽干10 min，10 mL有机洗脱溶剂洗脱，收集洗脱液，于35 ℃以下缓慢氮吹浓缩至5 mL，经少量无水硫酸钠干燥后进样。

1.2.3 标准溶液的配制

将1 mg·L-1 N-亚硝胺混合标准溶液用乙腈稀释定容至10 mL，得到浓度为200 mg·L-1的混合标准储备溶液。取适量NDMA-d6、NDPA-d14内标物用乙腈溶解配制成浓度为5 mg·L-1的内标储备液。

取400 μL浓度为5 mg·L-1内标储备液，用二氯甲烷定容至10 mL，得到浓度为200 μg·L-1内标稀释液。取50 μL浓度为200 mg·L-1的混合标准储备液与200 μL浓度为5 mg·L-1的内标储备液，用二氯甲烷定容至5 mL，得到N-亚硝胺浓度为2 000 μg·L-1混合标准中间溶液（内标物氘代N-亚硝胺浓度为

200 μg·L-1）。将此混合标准中间溶液用200 μg·L-1内标稀释液逐级稀释并定容至1 mL，得到浓度分别为25、50、100、200、500、700 μg·L-1及1 000 μg·L-1的系列标准工作溶液。

1.2.4 加标样品的制备

取250 μL浓度为200 mg·L-1的N-亚硝胺混合标准溶液，用乙腈稀释定容至10 mL，得5 mg·L-1的加标母液。向50 g空白样品中分别加入50、100、200 μL加标母液，即得浓度分别为5、10、20 μg·kg-1的加标样品。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

通过调整气相色谱的参数，使用DB-1701色谱柱有效地分离了5种N-亚硝胺类化合物，实现了无杂峰干扰。按1.3.1项确定的色谱条件，对N-亚硝胺类化合物标准工作液进行全谱扫描分析，以确定用于定性和定量分析的离子对。在多反应监测模式下，对碰撞能量进行了优化，以增强定性和定量离子信号强度，优化后各化合物的质谱参数如表1

所示。

2.2 前处理方式的优化

2.2.1 QuEChERS法

N-亚硝胺化合物因其分子质量较低且具有较强的极性，在极性溶剂中具有较好的溶解度，常见的提取溶剂包括乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯[18]。NaCl可以增强水相离子强度，减小N-亚硝胺类化合物在水中的溶解度，同时减少水相与有机相的乳化现象，提高萃取效率，因此在提取过程中可以加入少量NaCl。在提取过程中，有机相中混入了少量水分，所以必须先使用无水Na2SO4进行脱水处理。发酵食品黄酒和酱油中通常含有色素、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸及糖类等复杂基质，容易影响测定的准确性。GCB石墨化碳黑能吸附色素与非极性化合物，PSA QuEChERS专用超洁净填料为正相硅胶键合吸附剂，可以吸附糖类、有机酸及少量色素。本研究对比了乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯3种溶剂及GCB、PSA两种净化剂对酱油、黄酒中N-亚硝胺类化合物的提取净化效果，结果见图1。

可以看出，乙腈对N-亚硝胺类化合物的提取效率最差，不同化合物的回收率差异明显；乙酸乙酯和二氯甲烷提取效果相当。综合考虑酱油与黄酒的提取净化效果，二氯甲烷-GCB提取效果较好，各N-亚硝胺类化合物回收率在80%～120%，可以满足定量分析要求。

2.2.2 固相萃取法

椰壳活性炭固相萃取小柱常用于N-亚硝胺类化合物的富集净化。本研究采用加标回收实验，对比了两种洗脱剂（乙腈和二氯甲烷）的洗脱效果，结果见图2。由图可知，乙腈对N-亚硝胺类化合物的洗脱能力较差，大部分化合物的回收率低于60%，而二氯甲烷对N-亚硝胺类化合物的洗脱能力较好，5种N-亚硝胺类化合物的回收率在90%～120%。

2.2.3 前处理方式的选择

QuEChERS法与固相萃取法对N-亚硝胺类化合物的提取富集效果相当，考虑操作步骤与操作过程中的自动化程度，选择全自动固相萃取仪对样品进行固相萃取前处理。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系

以目标物与内标物峰面积比为纵坐标，以二者的浓度比为横坐标绘制标准曲线，线性方程见表2。5种N-亚硝胺类化合物浓度在25～1 000 μg·L-1线性关系良好，相关系数均在0.996 0以上。

表2 5种N-亚硝胺的线性回归方程

化合物 线性回归方程 相关系数

NDMA y=1.227 447x 0.996 2

NMEA y=2.741 539x 0.999 3

NDEA y=1.925 023x 0.998 6

NDPA y=1.174 302x 0.998 8

NMOR y=2.082 529x 0.999 0

2.3.2 检出限和定量限

分别以超过3倍和10倍信噪比（S/N）对应的浓度确定方法的检出限和定量限，结果见表3。在取样量为50 g、定容体积为5 mL时，黄酒和酱油基质中N-亚硝胺类化合物的检出限在0.1～0.8 μg·kg-1，定量限在0.3～2.8 μg·kg-1。

2.3.3 回收率和精密度

在标准曲线范围内，选取3个梯度浓度对空白样品进行加标，经固相萃取净化后，进行加标回收实验，结果见表4。由表中结果可知，5种N-亚硝胺类化合物的回收率在76.2～112.1%，相对标准偏差在2.1%～8.1%。所建立的方法能满足酱油、黄酒中N-亚硝胺类化合物的分析要求。加标回收率与精密度结果均达到《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）中的要求。

2.3.4 实际样品的检测

随机选取市售酱油、黄酒样品各3批次，经固相萃取净化后，按照1.2.1项仪器条件测定样品中NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NMOR等5种N-亚硝胺类化合物的含量，结果显示仅有1批次样品检出NDPA，其余样品均未检出N-亚硝胺类化合物。

3 结论

本研究应用固相萃取技术、程序升温进样-气相色谱串联三重四极杆质谱技术，建立了一种能够同时测定酱油、黄酒中5种N-亚硝胺类化合物的分析方法。实验结果表明，方法的线性关系良好，检出限与定量限较低，加标回收率及精密度均符合相关标准的规定，可以满足日常检测需求。

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基金项目：绍兴市科技局产业关键技术攻关计划（2022B43003）；浙江省省地协同项目（2024SDXT001-7）。

作者简介：马嘉俊（1992—），男，浙江绍兴人，本科，工程师。研究方向：食品检测。

通信作者：刘镇（1986—），女，江西上饶人，博士，高级工程师。研究方向：食品检测。E-mail： Liuz617@163.com。