高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱法测定大米5种硒形态

摘 要：建立了一种采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪测定大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）]

5种硒形态的分析方法。利用小麦粉质控样（ERM-BC210a）中硒代蛋氨酸的测定回收率分析优化硒形态的提取效果；以O2作为反应池气体，在硒元素质量转移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100为分析柱，以5 mmol·L-1的柠檬酸溶液（pH=5.0）为流动相，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用法检测。结果表明，在0.5～200.0 μg·L-1，各硒形态线性关系良好，相关系数均大于0.999 5；SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）检出限分别为0.002、0.004、0.005、0.002 mg·kg-1和0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、0.250 mg·kg-1 3个加标水平下，各硒形态的平均加标回收率为79.9%～106.3%。10批海南地区大米中主要检出的硒形态为SeMet，其他硒形态均未检出。该方法准确、灵敏，可满足大米中硒形态的

定量分析。

关键词：硒形态；大米；高效液相色谱-电感耦合等离子串联质谱联用仪

Determination of Five Selenium Species in Rice by High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Tandem Mass Spectrometry

FU Yufu， WEI Ying， LIU Dongni， KANG Rui， LIN Zhifan， GU Mantun*

（Institute of Food Testing， Hainan Academy of Inspection and Testing， Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570314， China）

Abstract： A method was developed for the determination of five selenium forms in rice， including selenocystine （SeCys2）， methyl-selenocysteine （MeSeCys）， selenite [Se（Ⅳ）]， selenomethionine （SeMet） and selenate [Se（Ⅵ）]， by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The recovery rate of selenomethionine in wheat flour quality control sample （ERM-BC210a） was used to analyze and optimize the extraction effect of selenium morphology. O2 was used as the reaction cell gas， selenium mass transfer Se （m/z 80＞

96） mode， Hamilton PRP-X100 was used as the analytical column， and 5 mmol·L-1 citric acid solution （pH=5.0） was used as mobile phase and was detected by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The results showed that in 0.5 to 200.0 μg·L-1， the linear relationship between selenium morphology was good， and the correlation coefficients were greater than 0.999 5， and the detection limits of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ） were 0.002 mg·kg-1， 0.004 mg·kg-1， 0.005 mg·kg-1， 0.002 mg·kg-1 and

0.001 mg·kg-1， respectively. The average recoveries of selenium forms were from 79.9% to 106.3% at the three spike levels of 0.025 mg·kg-1， 0.100 mg·kg-1 and 0.250 mg·kg-1. SeMet was the main selenium form detected in 10 batches of rice from Hainan， while no other selenium forms were detected. This method is accurate and sensitive， which can meet the quantitative analysis of selenium form in rice.

Keywords： selenium species; rice; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry

硒元素是人体必需的一种微量元素，其通过抗氧防御机制参与人体免疫系统防御，增强抗病毒能力、排毒与抗氧化功能等[1]。饮食摄取是人体补硒最主要的途径，但是我国是较严重的缺硒国家之一。据统计，我国有72%的地区缺硒，其中29%为严重缺硒地区[2]；2006年海南省地质调查院首次宣布在海南岛发现富硒土壤占全岛总面积的28.14%，主要分布在海南岛中东部地区[3]。海南硒资源位居全国前列，同时是粮食作物水稻的主要种植地区，但针对海南地区大米中的硒含量及硒形态的研究报道较少。

目前，测定大米中硒元素的方法较多，主要包括氢化物发生-原子荧光光谱法（Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）、电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）等。其中，HG-AFS法操作简便，但灵敏度较低；ICP-MS法灵敏度高[4]，但其采用氦气碰撞模式，由于氩原子离子、稀土双电荷等对丰度最高的80Se有干扰[5]，常选用丰度较低的78Se作为硒元素的检测质量数，信号响应较低。本研究采用的电感耦合等离子体串联质谱（Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，ICP-MS/MS）技术具备两组四极杆质量过滤器，在O2反应模式下，硒元素检测质量数可由80Se+转换成80Se16O+，由此可消除多原子离子等干扰[6]，可使检测结果更准确、更灵敏；同时利用液相色谱技术与ICP-MS/MS相结合，在O2模式下，可使硒形态检测结果更加准确。

本研究建立同时测定海南大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）] 5种硒形态的高效液相色谱-电感耦合等离子串联质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS/MS）分析方法，以获得更准确的检测结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米，产自海南海口、琼海、五指山等市县，共计10批次。

SeCys2溶液标准物质[GBW 10087，（44.2±

1.0）μg·g-1，以Se计]、MeSeCys溶液标准物质[GBW 10088，（34.8±1.0）μg·g-1，以Se计]、Se（Ⅳ）溶液标准物质[GBW 10032，（42.9±0.9）μg·g-1，

以Se计]、SeMet溶液标准物质[GBW 10034，（39.4±1.0）μg·g-1，以Se计]、Se（Ⅵ）溶液标准物质[GBW 10033，（41.5±1.3）μg·g-1，以Se计]，中国计量科学研究院；小麦粉质控样[批号ERM-BC210a，硒代蛋氨酸标示值（27.4±2.6）mg·kg-1]，英国LGC公司；胰蛋白酶γ（CAS：9002-07-7），国药集团；蛋白酶K（CAS：39450-01-6），麦克林；链蛋白酶E（CAS：9036-06-0），上海源叶生物；硝酸（优级纯），德国默克；三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS-HCl，纯度99%），阿法埃莎化学；氨水（色谱纯），德国默克；Milli-Q超纯水，德国默克。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪，美国Agilent；8900型感耦合等离子体串联质谱仪，美国Agilent；阴离子交换色谱柱Hamilton PRP-X100（150 mm×

4.6 mm，5 μm）；Thermo IonPac AS19（250 mm×

4 mm）；Thermo IonPac AS7（250 mm×4 mm）；MARS型微波消解仪，美国培安；XS204型电子分析天平，瑞士梅特勒；SHZ-C型恒温振荡水浴，上海龙跃；SK7200B 超声波清洗器，上海科导；Multi reax（EX）涡旋混合器，德国海道夫；Million Q型超纯水器，德国默克。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

精密称取2 g大米粉于15 mL离心管中，加入链霉蛋白酶E 20 mg与样品混匀，加入10 mL

75 mmol·L-1 Tris-HCl提取液，涡旋振荡混匀

1 min，超声30 min后，于37 ℃恒温水浴振荡4 h，10 000 r·min-1离心3 min，上清液过0.22 μm水系滤膜，滤液为待测液。

小麦粉质控样ERM-BC210a根据证书含量计算，准确称取0.3 g样品于50 mL离心管中，后续操作同样品一致。

1.3.2 溶液配制

混合标准储备液：用电子分析天平分别称取一定量的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2和Se（Ⅵ）标准物质，用水稀释并定容，分别得到质量浓度为10 μg·mL-1的标准储备液。

混合标准中间液Ⅰ：各取1 mL的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2、Se（Ⅵ）标准储备液，用水定容至10 mL的容量瓶中，得到1 µg·mL-1的5种混合标准中间液Ⅰ。

混合标准中间液Ⅱ：取1 mL的混合标准中间液Ⅰ，用水定容至10 mL的容量瓶中，得到

100 µg·L-1的3种混合标准中间液Ⅱ。

用移液枪分别吸取一定体积的混合标准中间液Ⅰ、Ⅱ，经空白基质溶液定容至1 mL，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的基质混合标准系列工作溶液。

1.3.3 仪器条件参数

（1）ICP-MS/MS。射频功率：1 550 W；扫描类型：串接；工作气：Ar；雾化气流速：

1.09 L·min-1；补偿气流速：0 L·min-1；辅助气流速：

0.90 L·min-1；采样深度：10.0 mm；反应气：O2；O2流速：30%；提取透镜1：0 V；提取透镜2：250 V；采集质量数：80＞96（m/z）；积分时间：0.3 s。

（2）HPLC。色谱柱：Hamilton PRP-X100柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：5 mmol·L-1柠檬酸溶液，pH=5.0（氨水调pH值）；流速：

1 mL·min-1；进样体积：50 μL。

1.4 数据处理

每个样品做3次平行实验，利用Origin 2021软件和Excel 2013进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

色谱分离提取样品中的不同硒形态化合物，需要破坏大米中蛋白质的肽键，使其处于游离态，并保证化合物的完整性，因此确保提取效果的关键在于提取方法的选择[7]。经查阅相关文献，大米中硒形态的提取方法有水提法、酸提法以及酶提法等[8]。本研究对比各方法的提取效果，结果发现使用以

75 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液作为提取溶液的酶提法提取的硒形态化合物相对较稳定，回收率较高。

研究表明，大米中硒的存在形态以SeMet为主，因此本研究选取小麦粉质控样中SeMet的回收率作为考察指标进行提取条件的优化。由图1（a）可知，当超声时间为30 min时，质控样回收率处于较高水平；之后随着超声时间的延长，质控样回收率变化不大，因此选择超声时间为30 min。

超声后样品在37 ℃下进行水浴振荡，不同振荡时间下的回收率变化趋势见图1（b）。当振荡时间为4 h时，质控样回收率处于较高水平；之后随着振荡时间的延长，质控样回收率变化不大，因此选择振荡时间为4 h。

2.2 提取酶种类及加入量的优化

本研究在10 mL 75 mmol·L-1 Tris-HCl提取溶液中加入蛋白酶K（记为K）、链霉蛋白酶E（记为E）、胰蛋白酶γ（记为γ）以及不同酶组合，考察不同酶组合提取条件下小麦粉质控样的回收率。结果发现，在含有链霉蛋白酶E的组合提取条件下，小麦粉质控样的回收率在92%～98%；对比单一酶提取质控样回收率，发现胰蛋白酶γ＜蛋白酶K＜链霉蛋白酶E[如图2（a）]。基于此，本文进一步考察链霉蛋白酶E加入量（10、15、20、25、

30 mg和35 mg）对质控样回收率的影响，结果表明当链霉蛋白酶E加入量为20 mg时，质控样回收率可达到98%，继续增加链霉蛋白酶E用量，质控样回收率变化不大[如图2（b）]。考虑测试成本的因素，本研究选用加入20 mg链霉蛋白酶E作为提取酶。

2.3 流动相和色谱柱优化

采用HPLC进行硒形态分离过程中，发现不同的硒形态在不同的pH值条件下的分离效果和保留时间有所差别，当提高流动相浓度或流动相pH值时，可明显缩短5种硒形态出峰时间，但前3个峰[SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）]的分离度会变差；相反，在合适条件下延长5种形态出峰时间，分离度则变好。本研究考察了不同pH值（4、5、6、7）、不同浓度（2、5、10 mmol·L-1）的柠檬酸溶液对5种

硒形态的分离情况。结果表明，选择pH=5、浓度为5 mmol·L-1的柠檬酸作为流动相，既具有良好的分离度，又能有较为适宜的出峰时间。

实验还对比了3种阴离子交换色谱柱Hamilton PRP-X100、Thermo IonPac AS19和Thermo IonPac AS7对分离效果的影响。结果表明，Thermo IonPac AS19色谱柱无法实现5种硒形态化合物的有效分离，Thermo IonPac AS7色谱柱测试分离时间太长，Hamilton PRP-X100则能在较短的时间内完成5种硒形态的分离。

2.4 线性关系、检出限

由图3可知，本方法能够在15 min内完成5种

硒形态的完全分离，出峰顺序依次为SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）。由表1可知，浓度为0.5～200.0 µg·L-1时，5种硒形态化合物的线性关系良好，相关系数r在0.999 6～

1.000 0。SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）检出限分别为0.002、0.004、0.005、0.002、

0.001 mg·kg-1。

2.5 精密度与回收率

采用空白海南地区大米样品进行3个不同浓度水平（0.025、0.100、0.250 mg·kg-1）的加标回收实验，每个浓度进行3次重复，结果见表2。5种硒形态的平均加标回收率在79.9%～106.3%，相对标准偏差为1.7%～5.7%，满足实际样品分析要求，可实现SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）等

5种硒形态的准确测定。

2.6 样品测定

将海南地区所采集的10批大米样品经前处理研磨成粉，采用本文建立的方法对其中的硒形态进行分析研究，结果表明，有9批大米样品中只检出SeMet，SeMet含量为0.007 7～0.025 8 mg·kg-1，未检出其他硒形态，与相关文献报道相符[9]。相较于其他硒形态，人体对食物中SeMet的生物利用效率较高[10]，后期可重点对富硒大米中SeMet的含量和功能进行深入研究。

3 结论

本研究采用HPLC-ICP-MS/MS技术以O2作为反应池气体，在硒元素质量转移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100分析柱，以5 mmol·L-1的柠檬酸溶液（pH=5.0）作为流动相，能够在一次进样中实现5种硒形态SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）完全分离和在线测定。5种硒形态在0.5～200.0 μg·L-1线性关系良好，相关系数r＞0.999 5，检出限分别为0.002、0.004、0.005、0.002、0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、

0.250 mg·kg-1 3个加标水平下，各硒形态的加标回收率为79.9%～106.3%，相对标准偏差在1.7%～

5.7%。该方法适用于大米中SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）含量的测定。

参考文献

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[10]FAIRWEATHER-TAIT S J，COLLINGS R，HURST R.Selenium bioavailability：current knowledge and future research requirements[J].Am J Clin Nutr，2010，91（5）：1484S-1491S.

基金项目：海南省自然科学基金青年基金项目（320QN375）；国家市场监督管理总局重点实验室（热带果蔬质量与安全）课题资助项目（ZZ-2022002）。

作者简介：符郁馥（1985—），女，海南文昌人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全检测。

通信作者：谷满屯（1991—），男，河南信阳人，硕士，工程师。研究方向：食品安全检测。E-mail： 375552783@qq.com。