大兴安岭草苁蓉全长转录组测序及生物信息学分析

摘 要 草苁蓉为东北道地药材，具有补肾壮阳，润肠通便，止血的功效，草苁蓉中含有草苁蓉多糖、草苁蓉环烯醚萜苷、草苁蓉酸等活性成分，具有丰富的药用价值。目前对草苁蓉的研究多集中于有效成分，药理性等方面，在转录组及功能基因方面的内容较少。为进一步了解大兴安岭草苁蓉的转录组，丰富其遗传信息利用高通量测序技术获得大兴安岭草苁蓉种子的转录组信息。利用转录组测序获得Unigene序列，将Unigene与七大功能数据库注释进行比对注释、SSR分析、CDS预测，得到草苁蓉转录组的信息。结果显示，共获得18.87 G的CleanData，各样本的有效数据量分布在5.4～7.06 Gb，Q30碱基分布在95.66%～97.45%，平均GC含量为49.35%。拼接出Unigene 57 799条，总长度为48 308 661 bp，平均长度为835.8 bp。大兴安岭草苁蓉与油菜（Brassica napus）序列相似度最高，47 035个（81.38%）基因注释到非冗余蛋白序列数据库（NR）， "33 653个（58.22%）基因注释到蛋白序列数据库（Swissprot），13 174个（22.79%）基因注释到京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG），27 886个（48.25%）基因注释到真核生物蛋白相邻类的聚簇数据库（KOG）， "42 506个（73.54%）基因注释到直系同源蛋白分组比对数据库（eggNOG），30 928个（53.51%）基因注释到基因本体论数据库（GO），29 642个（51.28%）基因注释到蛋白家族数据库（Pfam）。预测出SSRs 11 031个，包含SSRs的Unigene有57 799条，包含大于1个SSRs的Unigene有1 886条，复合型SSRs943个。预测出 "53 033条CDS序列，其中数据库比对方法预测出47 140条，ESTScan预测出5 893条。研究结果丰富了大兴安岭草苁蓉的转录组数据，为深入研究大兴安岭[JP3]草苁蓉生物学特性及分子机制等提供参考，也有利于其资源开发和保护利用。[JP]

关键词 草苁蓉；全长转录组测序；大兴安岭；代谢通路；生物信息分析

草苁蓉（Bosehniakia rossica）为列当科草苁蓉属植物，多分布于中国黑龙江、吉林、内蒙古等地区。全草入药，味甘咸，性温，功效补肾壮阳，润肠通便，止血，用于肾虚阳萎、腰关节冷痛、便秘等，具有丰富的药用价值[1-5]。草苁蓉种子中含有草苁蓉多糖、草苁蓉环烯醚萜苷，草苁蓉苷、草苁蓉酸等活性成分[6-8]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝等作用[9-10]。

董学花等[11]研究发现，草苁蓉环烯醚萜苷能抑制人肝癌HepG2细胞活力，降低细胞黏附率，还能显著下调TGF-β1诱导后HepG2中MMP2、MMP7、MMP9、Snail、Slug蛋白表达，说明草苁蓉环烯醚萜苷具有抗肿瘤作用；李香丹等[12]对采用四氯化碳植物油混悬液建立肝纤维化模型大鼠，与模型组相比，草苁蓉环烯醚萜苷给药组能明显降低肝组织中的ALT、AST、TBIL水平，减轻肝纤维化程度，说明草苁蓉环烯醚萜苷对肝损伤有一定的保护作用；郑峰等[13]研究发现，经草苁蓉环烯醚萜苷灌胃后可使肝癌大鼠血清中的MDA、GST水平降低，增加SOD活性，说明草苁蓉化学醚萜苷能通过抗氧化作用进而发挥抗肿瘤作用；此外，草苁蓉多糖能抑制炎症因子的表达，如IL-β、IL-6、TNF-α等，还能降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中COX-2、MyD88蛋白含量[14]。

草苁蓉最早记载于唐《新修本草》[15]。大兴安岭以浅山丘陵为主，属中温带大陆性季风气候。草苁蓉性耐寒冷，喜爱冷凉气候，大兴安岭的主要生态因子都适宜草苁蓉生长，故草苁蓉成为大兴安岭道地药材之一[16-18]。有关草苁蓉分子生物学、转录组和功能基因的相关信息较少，在一定程度上制约了草苁蓉研究的进展。[JP3]因此利用高通量测序技术对草苁蓉种子进行分析，为扩大草苁蓉资源，进一步探索其功能基因信息提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大兴安岭草苁蓉转录组测序材料于2022年9月在大兴安岭地区采集，采集多个植株生长成熟的草苁蓉种子，用锡纸包裹并快速放入液氮处理，置于-80 ℃保存备用。

1.2 大兴安岭草苁蓉种子RNA抽提和文库构建

用TRIzo（ThermoScientific，货号A33251）提取总RNA，采用NanoDrop2000分光光度计（ThermoScientific， USA）检测RNA纯度和定量，并用Agilent2100生物分析仪（AgilentTechnologies， SantaClara， CA， USA）评估RNA完整性。然后根据说明书使[JP3]用VAHTS Universal V6RNA-seqLibraryPrep试剂盒（Vazyme-innovation in enzyme technology，USA）构建转录组文库。[JP]

1.3 转录组测序与组装

文库质量经Agilent 2100生物分析仪质检合格后，使用IlluminaNovaseq6000测序平台进行测序，生成150 bp的双端序列。建库测序先经过种子总RNA提取与RNA的质量检测，再对RNA进行富集、片段化逆转录生成cDNA，最后PCR扩增完成上级测序，此步骤及部分数据分析由上海欧易生物医学科技有限公司完成。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别（BaseCalling）分析转化为原始测序序列，称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。通过测序，得到大量的样本双端测序数据。采用fastp软件对原始数据进行质量预处理，首先对原始数据进行质控并去除接头，再从3′端及5′端以不同方式去除低质量碱基，最终得到高质量的cleanreads。用Trinity软件paired-end的拼接方法得到Transcript序列，根据序列相似性以及长度，挑选出最长的序列作为Unigene；之后再利用CD-HIT软件聚类去冗余得到最终的Unigene，以此作为后续分析的参考序列。

1.4 Unigene功能注释

对NR、COG、KOG、GO、Swiss-Prot、eggNOG、KEGG数据库注释，采用diamond软件进行比对，取elt;1e-5的注释，筛选具有最高序列相似性的蛋白，从而得到功能注释信息。对于Pfam数据库注释，采用HMMER软件和蛋白家族模型比对，从而筛选出得分最高的家族。

1.5 CDS预测

将Unigene序列与NR、SwissProt和KOG数据库作对比，直到与所有蛋白数据库对比完，剩余对比不上的Unigene的编码区采用ESTScan（3.0.3） 软件预测，获得其编码区的核酸序列（序列方向5′-gt;3′）和氨基酸序列。

1.6 SSR分析

利用MISA进行SSR预测，然后利用Primer3将获得的大兴安岭草苁蓉种子SSR位点的序列以退火温度60 ℃±2 ℃、引物长度20 bp左右、PCR产物长度100～300 bp 为条件进行引物设计。

2 结果与分析

2.1 转录组测序和denovo组装

对大兴安岭草苁蓉种子样本进行转录组测序，每个样本重复3次，共获得18.87 Gb的CleanData，各样本的有效数据量分布在5.4～7.06 Gb，Q30碱基分布在95.66%～97.45%，平均GC含量为49.35%。上述数据说明获得的转录组数据质量较好，可用于后续的分析处理（表1）。

使用Trinity将cleanreads进行denovo组装成转录本，去冗余后共获得57 799条Unigene，总长48 308 661 bp，平均长度为835.8 bp，N50为 "1 075 bp；其中长度大于等于500 bp的有35 255条序列，占比61.00%；15 752条序列长度大于等于1 000 bp，占比27.25%，见图1。

2.2 Unigene功能注释

大兴安岭草苁蓉组装后的Unigene序列与7个常见数据库比对，见表2。其中注释到Unigene最多的数据库为NR数据库，有47 035条，占 "81.38%，KEGG数据库被注释到的Unigene最少，有13 174条，占22.79%。

为了解大兴安岭草苁蓉种子的相近物种情况，将其转录组序列与NR库数据比对，匹配较多的物种主要有油菜（Brassica napus）、芝麻（Sesamum indicum）、芸苔属植物（Brassica rapa）、独脚金（Striga asiatica）、紫花风铃木（Handroanthus impetiginosus），分别占12.09%、12.00%、8.83%、6.49%、5.84%。结果显示大兴安岭草苁蓉种子与油菜（Brassica napus）具有的同源序列匹配度比例最高， 见图2。

2.3 KEGG功能注释

KEGG数据库注释结果显示有关大兴安岭草苁蓉糖类的合成与代谢的Unigene被注释335条，有关萜类和多酮化合物代谢的Unigene有263条，这3类Unigene可能与大兴安岭草苁蓉的活性成分的合成与代谢有关，见图3。根据KEGG数据库比对，筛选出参与大兴安岭草苁蓉种子活性成分合成通路的 Unigene，包括132条Unigene涉及萜类骨架生物合成，129条Unigene涉及精氨酸生物合成，128条Unigene涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，90条Unigene涉及类固醇生物合成，87条Unigene涉及泛醌和萜类醌生物合成，85条Unigene涉及叶酸生物合成，64条Unigene涉及赖氨酸生物合成，60条Unigene涉及三萜、哌啶和吡啶生物合成，56条Unigene涉及异喹啉生物碱生物合成，40条Unigene涉及类胡萝卜素生物合成，38条Unigene涉及单环类生物合成，30条Unigene涉及类黄酮生物合成，13条Unigene涉及二萜类生物合成，9条Unigene涉及单萜类生物合成。

2.4 GO功能注释

对大兴安岭草苁蓉转录组Unigene进行GO功能注释，共分类到BP、CC和MF" 3个GO类别的44个条目中。其中，在第一大类BP中，共包含21个条目，其中Cellularprocess（细胞过程）和Metabolicprocess（代谢过程）基因数量最多；在第二大类Cellularcomponent（细胞成分）中，共包含有13个条目，其中Cell（细胞）、Cellpart（细胞组分）的基因数量最多；第三大类MF中，共包含有10个条目，Binding（结合因子）和Catalyticactivity（催化因子活性）的基因数量最多，见图4。

2.5 KOG功能注释

KOG数据库注释了60 500个转录本，按照KOG功能分类可分为25个组，见图5。其中，“一般功能预测”的转录本最多，共4 778个；“蛋白质翻译后修饰、蛋白周转、分子伴侣”的转录本有3 380个；“翻译、核糖体结构与生物发生”的转录本有2 998个。此外，发现“次生代谢物生物合成、转运与代谢”等相关的转录本有806个，这些转录本可能与大兴安岭草苁蓉中有效成分的合成途径有关。

2.6 编码序列（CDS）分析

对大兴安岭草苁蓉转录组所有Unigene的CDS序列进行预测，共预测出53 033条CDS序列，其中数据库比对方法预测出47 140条。对预测的CDS序列长度进行整合，其中长度≥500 nt的序列占总序列数的比例为48.32%，长度≥ "1 000 nt的序列占总序列数的比例为18.69%。ESTScan预测出5 893条，对预测的CDS序列长度进行整合，其中长度≥500 nt的序列占总序列数的比例为16.14%，长度≥1 000 nt的序列占总序列数的比例为1.49%，见图6和图7。

2.7 简单重复序列（SSR）分析

根据组装结果，使用MISA软件对Unigene的SSR进行检测，将SSR统计结果按重复类型分为6类，共11 031条SSR。其中最丰富的重复类型为单碱基重复，共有5 281条（占47.87%）；其次为双碱基重复和三碱基重复类型，分别为 "2 998条（占27.18%）和2 497条（22.64%）；其余为四、五和六碱基重复类型，共255条（占 "2.31%），见表3。根据引物设计条件获得了 "10 088条符合条件的引物（表4），这将为后续草苁蓉分子标记的开发提供参考。

3 讨论与结论

转录组分析能获得植物的功能基因从而了解植物在生长发育阶段的调节机制，草苁蓉转录组测序结果显示，大兴安岭草苁蓉种子共获得 "18.87" Gb CleanData，经过建库测序与生物信息分析得知Q30达到97.45%，GC含量为 "49.35%，表明大兴安岭草苁蓉种子转录组测序数据质量优良。通过denovo组装，共获得57 799条转录本，其中序列长度大于等于500 bp的有 "35 255条，平均长度为835.80 bp，N50为1 075 bp，表明大兴安岭草苁蓉转录组序列组装质量较高。序列比对显示大兴安岭草苁蓉种子与油菜（Brassica napus）和芝麻（Sesamumin dicum）亲缘关系最为接近。通过KEGG功能注释，其中有关大兴安岭草苁蓉糖类的合成与代谢的Unigene被注释335条，有关萜类和多酮化合物代谢的Unigene有263条，有关其他次生代谢物的生物合成的Unigene有342条。草苁蓉发挥药效的主要化学成分为草苁蓉多糖等，糖类作为物质代谢的碳骨架能为植物提供能量，研究表明多糖类化合物参与了细胞各种生命现象的调节，具有多种生理活性[19]，因此对该类Unigene的挖掘和分析具有重要的研究意义。萜类化合物广泛分布于自然界，具有保护植物细胞膜，刺激植物产生内源激素并且保护植物免受强光的伤害等作用[20]，其中三萜皂苷不仅能为植物抵御病原体还具有多种药理活性[21]，转录组测序结果显示有关萜类和多酮化合物代谢的Unigene有263条，这些Unigene可能与大兴安岭草苁蓉种子中萜类成分的合成与代谢有关。目前，SSR标记已在苹果等不同抗性植物的分子遗传学检测中得到很好的应用，本研究共检测到11 031条SSR，其中最丰富的重复类型为单碱基重复，共有5 281条，为资源利用与药材鉴定提供参考。大兴安岭草苁蓉种子在调节碳代谢、氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢等方面的基因可能是在生长发育时期应对低温胁迫的基础。本研究对大兴安岭草苁蓉种子进行了转录组测序分析，获得大量转录水平数据，丰富了对草苁蓉道地产区基因的认识， 为今后草苁蓉功能基因的进一步探索提供了一定的数据参考， 同时也为日后基因工程技术对草苁蓉进行遗传改良奠定了理论基础。

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Full-length Transcriptome Sequencing and Bioinformatics Analysis of Boschniakia" rossica in Daxing’an Mountains

Abstract Boschniakia rossica is a valuable medicinal materials native to northeastern China，known for its therapeutic effect in strengthening kidney function，combating constipation， and promoting hemostasis.It contains active compounds such as Boschniakia rossica polysaccharides， Iridoid glucosides，Boschniakia rossica acid， all contributing to its significant medicinal value.To further explore the transcriptome of stanche from Daxing’an Mountains and enhance its genetic database， we conducted a full-length transcriptomic analysis of Boschniakia rossica seeds using high-throughput sequencing technology.Through transcriptomes squencing we obtained Unigene sequence，followed by functional annotation， SSR （Simple Sequence Repeat） analysis and CDS （Coding Sequence） prediction， and an in-depth analysis of genetic information.The results showed that the a total of 18.87 Gb" of clean data was obtained， with the effective data per sample ranging from 5.4 to 7.06 Gb.The Q30 base quality score ranged from 95.66%" to 97.45%， and the average GC content was 49.35%.We identified 57 799 Unigen sequnces， with a total length of 48 308 661 bp and an average length of" "835.8 bp.The Boschniakia rossica seeds transcriptome showed the highest sequence similarity to Brassica napus.Functional annotations revealed that 47 035（81.38%） genes were annotated in the NR database，" "33 653（58.22%） in Swissprot， 13 174（22.79%） in KEGG， 27 886（48.25%） in KOG， 42 506 "（73.54%） in eggNOG， 30 928（53.51%） in GO， 29 642（51.28%） in Pfam.11 031 SSRs were predicted， with" "57 799 Unigene containing SSRs， 1 886 Unigene containing more than 1SSRs， and compound SSRs 943 predicted.A total of 53 033 CDS sequences were predicted， with 47 140 were predicted by the database alignment and 5 893 by ESTScan.These findings enrich the transcriptome data of Boschniakia rossica， and provide a reference for further studying the biological characteristics and molecular mechanism of Boschniakia rossica.This study also lays a foundation for the sustainable exploitation， protection， and utilization of Boschniakia rossica resources.

Key words Boschniakia rossica; Full-length transcriptome sequencing;Daxing’an Mountains;Metabolic pathway; Bioinformatics analysis