犬源细小病毒兰州株的分离鉴定与VP2基因的遗传进化分析

摘 要 为了解近年来甘肃省兰州市犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）的基因型分布情况及遗传进化方向，于兰州市宠物医院采集8份细小病毒阳性（试纸条检测）的犬粪便样品，使用F81细胞分离病毒；利用PCR、间接免疫荧光试验、血凝试验鉴定所分离的病毒；随后分析病毒基因型和 "VP2基因的遗传进化关系。结果显示，共分离得到7株细小病毒，1株为New CPV-2a型CPV，5株为CPV-2c型CPV，1株为猫细小病毒（Feline parvovirus，FPV）。VP2氨基酸序列同源性及进化分析结果显示，分离到的CPV-2c型毒株VP2同源性为100%，与北京、江苏等地分离株的亲缘关系较近；New CPV-2a型毒株与吉林、西安等地的分离株亲缘关系较近；犬源猫细小病毒（LZ05）与已报道的FPV毒株相比，存在91S→A、322V→T独特的突变，且与2020年北京一株犬源猫细小病毒分离株亲缘关系最近。

关键词 犬细小病毒；分离鉴定； VP2； 遗传进化分析

犬细小病毒病的主要病原是犬细小病毒 "（Canine parvovirus，CPV），该病根据临床表现分为心肌炎型、胃肠炎型和混合型[1]。其中，胃肠炎型较为多见，其临床症状主要为血便、呕吐、肠炎、脱水等[2]。犬细小病毒病的临床发病率和死亡率极高，对宠物的健康造成了极大的威胁[3]。

CPV是细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属家族（Parvovirus）的成员，为无囊膜的单股负链DNA病毒，病毒粒子直径20～25 nm，呈二十面体对称结构。病毒基因组全长4.5～5.5 kb，含有两个开放阅读框，ORF1和ORF2，分别编码两种非结构蛋白（NS1和NS2）和两种结构蛋白（VP1和VP2）[4]，其中，VP2是决定病毒的宿主特异性、抗原性及组织嗜性的主要蛋白，也是鉴定病毒基因型的主要靶标[5-6]。CPV-2被认为是由FPV跨种传播而来[7]，自1978年被发现以来，CPV-2毒株不断进化并形成了多个亚型[6]，包括CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c。近年来，CPV-2c毒株迅速席卷世界各国，成为许多国家和地区CPV的主要流行毒株[8]，不同地区的CPV-2c毒株在进化过程中形成了不同的分支，如亚洲/欧洲/美洲CPV-2c亚型。2018年以来，CPV-2c毒株在中国多地迅速流行，正在逐步替代CPV-2a和CPV-2b型毒株，成为国内的主要流行毒株[1-9]。

预防犬细小病毒病的方式主要为疫苗接种，大多数CPV商品化疫苗是用CPV-2毒株制备；然而，由于免疫覆盖率低、病毒变异、免疫程序不完善等原因，临床上犬细小病毒病的发病率仍居高不下[10-11]。因此对临床犬细小病毒进行分离鉴定及分子流行病学分析十分必要。本研究收集兰州市宠物医院细小病毒阳性犬的粪便样品，分离鉴定样品中的细小病毒毒株，并对分离株的VP2蛋白进行遗传进化分析，以期明确兰州市犬细小病毒的流行情况和分子特征，为犬细小病毒病的预防和疫苗的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材" 料

1.1.1 样本的采集与细胞系 2021年7月-2022年7月，从兰州市 5 家宠物医院（城关区1 家，七里河区2 家，安宁区1 家，西固区1 家）采集细小病毒阳性（试纸条检测）犬的粪便样品，放在灭菌过的 2 mL EP管中，封口，标记采样日期、发病动物品种等信息，-20 ℃冰箱保存。

猫肾传代细胞系（F81）购自中国科学院上海细胞库，并由甘肃农业大学兽医微生物与免疫学实验室保存。

1.1.2 主要试剂 MEM-Alpha培养基、胎牛血清为Gibco公司产品，青霉素-链霉素溶液购自赛默飞世尔科技公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由擎科生物科技有限公司合成；2×Taq PCR Master Mix购自Takara生物技术有限公司；抗细小病毒犬源单克隆抗体由兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室与甘肃农业大学兽医微生物与免疫实验室联合制备并保存；FITC标记的山羊抗犬IgG抗体为Bio-Rad公司产品；DAPI溶液购自Solarbio生物科技有限公司。

1.2 方" 法

1.2.1 样品处理 向采集的粪便样品中加入2 mL无菌PBS，37 ℃震荡10～20 min；4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，取1 mL上清于灭菌EP管中，加等量氯仿，充分震荡1 min；12 000" "r/min离心10 min，取上清转移至无菌EP管中，按照500 U/mL的浓度加入双抗（青霉素-链霉素），37 ℃作用2～3 h，用0.22 μm滤器过滤后保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.2.2 病毒的分离培养 F81细胞传代培养，待其贴壁后，用PBS清洗一遍，加1 mL无血清MEM-α培养基，再加入100 μL处理后的样品，置于37 ℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，每间隔10 min轻轻晃动一次；2 h后弃上清，补加细胞维持液（含3%胎牛血清），同时设立不接毒的细胞对照，每天观察细胞生长状态及病变情况。当细胞病变达到80%以上时，收取细胞培养物；72 h仍未出现病变的，于72 h收取细胞培养物。 "-80 ℃冰箱反复冻融3次后，4 ℃、12 000 r/min离心 "8 min，收集上清液。用以上方法盲传3代后进行PCR鉴定，选择CPE明显且PCR检测结果为阳性的，继续传代3次后做进一步鉴定。

1.2.3 PCR鉴定 根据参考文献[12]合成犬、猫细小病毒通用鉴定引物及 "VP2全长基因的扩增引物。提取第3代病毒培养物的DNA，用鉴定引物进行PCR检测。反应体系为：模板DNA" "2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O补至50 μL。反应程序为： "95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，56 ℃退火 "15 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸 "5 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.2.4 血凝（HA）试验 采集新鲜抗凝猪血，处理后制备1%猪红细胞悬液。在96孔V型血凝板中加入25 μL待检病毒液，并连续2倍倍比稀释，最后一孔作为阴性对照；然后每孔再加入 "25 μL 1.0%猪红细胞悬液，振荡混匀1 min，室温反应30 min后观察结果。以出现50%凝集病毒液的最大稀释倍数作为该病毒的血凝效价，血凝效价低于1∶8的，判定为阴性，等于或者高于 "1∶8的，则判定为阳性[11]。

1.2.5 间接免疫荧光试验（IFA） 消化后的F81细胞接种于24孔板（每孔约5.0×103个细胞），将病毒液10倍稀释后，按照每孔400 μL同步接毒，同时设阴性对照。37 ℃细胞培养箱孵育36 h后，弃上清，用-20 ℃预冷的甲醇∶丙酮 "（1∶1）固定液，室温下固定20 min。用PBS洗细胞3次，按5 μg·mL-1浓度加入抗细小病毒犬源单克隆抗体（该抗体通过单个B细胞抗体技术制成，经验证可以与CPV和FPV发生特异性反应），37 ℃孵育1 h，PBS洗细胞3次，然后加入FITC标记的山羊抗犬IgG抗体（1∶1 000稀释），37 ℃孵育1 h，用PBS洗细胞4次，DAPI 溶液孵育10 min，PBS浸洗4次，在荧光显微镜下观察结果。

1.2.6 ""VP2全长扩增及测序 取200 μL病毒液，提取DNA后，以病毒DNA为模板，PCR扩增 "VP2全长。具体反应体系和反应程序同 "“1.2.3”，退火温度为58 ℃。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，将扩增结果为阳性的PCR产物送至爱基百客（武汉）生物科技有限公司进行测序。

1.2.7 VP2氨基酸序列同源性分析 运用SnapGene软件对测序结果进行拼接，将获得的 "VP2基因序列与NCBI上已公布的CPV标准毒株（登录号：M38245、M24003、MN451666、EF599098、AY742955、GU380303），CPV疫苗株（登录号：FJ011098、FJ97847）；FPV标准毒株（登录号：EU659111），FPV疫苗株（登录号：EU498681、EU498680）及72株国内外不同基因型的CPV分离株进行比对分析。运用DNAStar程序分析所分离毒株的基因型、氨基酸序列同源性及变异情况，用MEGA 7.0 Neighbor-joining程序（参数设置为1 000 replications）绘制系统进化树并用iTOL程序进行修饰。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离培养

1～8号阳性样品经处理后接种于F81细胞，盲传3代。除6号样品外，其余7个样品接种细胞后，细胞均在48 h内出现皱缩、变形（两端呈丝状）、脱落等细胞病变效应（图1）。

2.2 PCR鉴定结果

提取第3代病毒培养液的DNA，用犬、猫细小病毒通用鉴定引物进行PCR检测（图2）。除6号样品外，以其他样品DNA为模板均能扩增出大小为451 bp左右的阳性条带，且阴性对照无条带。将这些毒株分别命名为LZ01、LZ02、LZ03、LZ04、LZ05、LZ07、LZ08。

2.3 血凝试验结果

将第6代病毒培养液与1.0%的新鲜猪红细胞悬液进行微量血凝试验（表1），这些毒株血凝效价为1∶23～1∶27，其中LZ04分离株的凝集价最高。

2.4 间接免疫荧光试验结果

将第6代细胞培养物同步接种F81细胞 "36 h后，用间接免疫荧光方法鉴定分离毒株。荧光显微镜下可见细胞核经DAPI染色呈蓝色，接毒细胞呈绿色荧光（图3），证实分离的病毒为细小病毒。

2.5 "VP2全长扩增结果

PCR扩增细小病毒分离株的 "VP2基因全长，结果如图4所示，从7个病毒分离株中均可扩增出2 177 bp大小的目的片段。经测序、拼接后将序列上传至NCBI，5株CPV-2c、1 株New CPV-2a和1 株犬源FPV毒株的 "VP2序列的登录号分别为OQ869252、OQ869253和OQ869254。

2.6 毒株基因型分析

使用Snap gene和MEGA 7.0软件分析 "VP2基因测序结果，参照标准毒株和文献[13]，根据VP2蛋7白14 个关键氨基酸位点对分离的细小病毒株进行基因型鉴定。结果显示（表2），分离到的7 株细小病毒中，1 株为New CPV-2a型毒株，5 株为CPV-2c型毒株。LZ05毒株的 "VP2关键氨基酸位点均与FPV一致，因此判定为FPV毒株。LZ01/LZ03/LZ04/LZ07/LZ08与CPV标准株相比均发生5G→A，370R→Q的突变；LZ05与其他FPV分离株相比发生91S→A、322V→T的突变。

2.7 VP2氨基酸序列同源性分析

使用DNAStar软件对犬、猫细小病毒 "VP2基因的氨基酸序列进行同源性分析，结果显示（图5），6株CPV分离株与CPV标准株氨基酸序列同源性为98.1%～99.7%，与CPV疫苗株氨基酸序列同源性为97.4%～98.1%；本次所分离到的5株CPV-2c型毒株（LZ01/LZ03/LZ04/LZ07/LZ08）的氨基酸序列同源性为100%；犬源FPV毒株（LZ05）与FPV标准株氨基酸序列同源性为99.7%，与FPV疫苗株氨基酸序列同源性为99.1%～99.3%，与中国北京、越南、泰国、埃及及意大利等地区犬源FPV氨基酸序列同源性为99.5%～99.7%。

2.8 VP2遗传进化分析

VP2氨基酸序列遗传进化树分析可见（图 6），CPV与FPV分为两个不同的类群，且CPV在进化过程中具有明显的地域性。本次分离得到的这 6 株CPV分离株均属于由中国、韩国、越南等地分离株组成的亚洲地区分离株群体。LZ02位于New CPV-2a亚群中，与2017年浙江（ZJ1579），2021年吉林（YBWQ）、江苏（JSYZ-93）、西安（XA-newCPV2a-0-2）及印度的分离株（PFA1）亲缘关系较近；LZ01/LZ03/LZ04/LZ07/LZ08均属于亚洲CPV-2c亚群，与2017年广西（CPV-GX1581），2019年江苏（CN/JS1707），2022年北京（CPV-BJ-C10、CPV-BJ-C3）及 2020 年韩国分离株（K01708-1）的亲缘关系较近，此分支还包括2017年兰州的一个分离株（CPV/canine/LZ/2/2017），但与其亲缘关系较远；此外，本次分离到的犬源FPV毒株（LZ05）与2021年中国北京分离到的犬源FPV毒株（2020/1）亲缘关系最近，但是属于不同的分支，与其他国家犬源FPV分离株亲缘关系较远，与疫苗株属于不同类群。[FL）]

3 讨" 论

自2010年在中国吉林省首次发现以来，CPV-2c型毒株在中国的检出率呈上升趋势。据报道，目前在吉林[14]、江苏、上海、浙江[15]、合肥[16]等地，CPV-2c毒株已经取代CPV-2a和CPV-2b，成为主要毒株类型。本次从兰州市7份CPV阳性犬粪便样品中分离到5株CPV-2c亚型毒株，表明CPV-2c亚型毒株正在逐渐取代CPV-2a/2b亚型，成为兰州市宠物犬中的主要流行毒株，这与中国CPV毒株的主要流行趋势一致。此外，与经典毒株序列相比，本次CPV-2c分离株VP2氨基酸序列有两个突变位点：第5位G→A、第370位R→Q，这两位点的突变在国内多个分离株中均有报道，被认为是亚洲CPV-2c亚型的独特位点[17]，也是亚洲和欧洲CPV-2c亚群的关键差异位点。

VP2氨基酸序列同源性分析结果显示，本研究分离到的6株CPV毒株与CPV-2疫苗株氨基酸序列同源性较低，说明疫苗对目前兰州市流行毒株的保护效力需要重新评估。本次分离的New CPV-2a型毒株（LZ02）与吉林、江苏、西安等地的分离株亲缘关系较近，且属于同一分支，说明其可能有共同的起源；5株CPV-2c型毒株VP2序列完全一致，且与中国的广西、江苏、北京分离株以及韩国的K01708-1分离株的亲缘关系较近，说明其可能具有相同的进化方式。此外，本次获得的分离株的VP2序列与2017年兰州分离株LZ/2/2017亲缘关系较远，说明近几年兰州地区CPV流行毒株已经发生了较大的变异。

值得注意的是，本研究在犬的粪便中分离到一株FPV毒株，这种现象在巴基斯坦[18]、泰国[19-20]、越南[21]、埃及[22]以及中国北京[1]均有相应报道。该毒株VP2氨基酸序列与FPV标准毒株及其他犬源FPV相比，发生了91S→A、322V→T的突变，其蛋白功能是否发生改变，是否能够同时感染犬和猫，以及跨物种传播的原因，还有待后续研究证实。VP2氨基酸序列遗传进化树显示，其与中国北京犬源FPV（2020/1）毒株亲缘关系最近，推测可能由北京分离株进化而来。近几年频繁从犬类粪便中分离或检测到FPV，这可能与犬的食粪行为有关[1]，也可能由于某些突变，使FPV的宿主范围扩大，对犬类健康构成了新的威胁。因此，需要提高对这一现象的重视，并加强对细小病毒的分子监测。

综上所述，兰州市犬CPV-2c亚型毒株感染持上升趋势，且其VP2氨基酸序列与国内主要流行毒株有较高的同源性。此外，本研究还从犬粪便样品中分离得到一株FPV，表明犬/猫细小病毒存在着混合或交叉感染的现象。随着CPV的传播以及 "VP2基因的不断变异，未来可能会出现新的毒株，这对目前所用疫苗的有效性构成新的挑战。因此，做好CPV的分子流行病学监测对于预测该病的发展以及开发更有效的疫苗或诊断试剂至关重要。

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Isolation，Identification of Parvovirus from Canine in Lanzhou and Phylogeny Analysis of" VP2 Gene Sequences

Abstract To investigate the genotype distribution and genetic evolution of canine parvovirus （CPV） in Lanzhou in recent years， eight fecal samples tested positive" using a canine parvovirus rapid test kit were collected from pet hospitals in Lanzhou. F81 cells were used for isolating parvovirus strains; PCR，indirect immunofluorescence and hemagglutination assays were conducted to identify the isolated strains;" additionally，the genotype and genetic evolution relationship were analyzed. The results showed that seven parvovirus strains were isolated，one strain belonged to" the New CPV-2a type，five strains were classified as CPV-2c type，and one strain was identified as Feline parvovirus （FPV）. The homology of amino acid sequences and evolutionary analysis showed that the VP2" sequences of these CPV-2c strain was 100% homologous and closely related to the strains found in Beijing and Jiangsu. The New CPV-2a strain exhibited similarities to those found in Jilin and Xi’an. Compared with the reported strains，FPV of canine origin （LZ05） had unique mutations （91S→A and 322V→T），and was found to be" most closely related to a strain isolated in Beijing in 2020.

Key words Canine parvovirus; Isolation and identification; "VP2；Genetic evolutionary analysis