低温胁迫下西瓜嫁接苗的蛋白质组学分析

摘 要 为了研究西瓜嫁接苗遭遇到低温胁迫后，蛋白表达丰度的变化，深入了解西瓜苗期耐冷响应过程中所涉及的代谢途径，探讨相关的分子调控机理。本研究对西瓜嫁接苗和自根苗进行低温处理，采用iTRAQ技术对其进行蛋白质组学的鉴定和定量分析，然后利用数据库进行比对，并采用GO及KEGG注释其功能和代谢通路，最终获得了差异蛋白985个，其中上调蛋白545个，下调蛋白440个，涉及以下4种主要类别的蛋白质：碳水化合物代谢（26.52%）、遗传信息翻译（19.78%）、能量代谢（17.83%）和氨基酸代谢（13.70%）。蛋白质组学分析显示，与自根苗相比，嫁接苗低温耐受性的增加与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco）的积累有关。

关键词 低温胁迫；西瓜；嫁接苗；蛋白质组学

近几年，中国设施栽培面积和产量不断增加，尤其是瓜类蔬菜。但是中国设施结构较为简陋，主要为拱棚和地膜覆盖。在早春时节极易受到倒春寒的影响［1］。低温冻害是冬、春季农业生产中，经常碰到的大面积灾害。在全球范围内，冷害也是阻碍农业种植的重要原因之一。作物在生长发育的过程中，需要适宜的温度才能正常生长，从而达到较为满意的产量和品质。较低的温度会抑制种子的萌发和根系的发育，从而导致一系列严重的后果，比如产生生理障碍、开花坐果时间延迟、化瓜、畸形果的概率升高等，同时低温还会阻碍果实的生长发育，比如阻滞果实内养分合成及运输，造成西瓜果实品质和产量降低［2］。

西瓜来自非洲，喜温喜光，最适宜生长温度苗期20 ℃～25 ℃、生长期25 ℃～30 ℃［3］。相关科学研究证明［4］，当气温低于10 ℃时，西瓜的幼苗发育会停滞，出现大面积的冻害现象，如果继续处在低温条件下，时间一长，幼苗将会面临死亡的威胁。在中国的设施栽培过程中，西瓜为了获得更好的经济效益，赶在五一前后上市，经常会在头年12月开始育苗，正值冬季，所以中国的设施西瓜生产经常会遇到低温弱光的天气，从而导致西瓜幼苗长势变弱、生长发育不良，进而给西瓜后期的产量和品质造成了不良影响。早春设施西瓜栽培，温度成为了制约西瓜产业化发展和农民增产增收的关键因素［5］。

目前已有研究表明嫁接可以提升瓜类蔬菜的耐低温能力［6］。通过嫁接，瓜类植物的根系发生了改变，砧木的根系活力更强，水分和养分吸收能力得到大大提升，植株通过提高水分和养分的供应，从而显著提高光合效率，同时植株的抗氧化防御系统也得到进一步改善，植物长距离运输能力也得到大幅度提高，包括激素信号、mRNA、RNAs和蛋白质在内，从而提高植株的抗逆性［7］。研究人员发现，嫁接后的甜瓜苗，细胞膜完整性明显优于自根苗，通过检测发现，嫁接苗叶片中的渗透调节物质（例如可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸）含量显著高于自根苗，还有包括SOD、CAT、POD在内的抗氧化酶活性也显著高于自根苗［8-9］；通过进一步分子生物学分析，可知植物抗寒相关基因（ CAT、 APX、 GolS1、 ERF1、 DREB1、 NAC、 bZIP2）的相对表达量也上调，这几方面的原因叠加后产生的结果提高了甜瓜的耐冷性［10］。西瓜与其相似，相关机理有相通之处。

通过生命科学的中心法则明确地知道，基因仅负责遗传编码，在生命活动中，毫无疑问，蛋白质才是真正起到作用的物质。Wilkins等［11］早在1994年提出蛋白质组学的概念，主要指从大规模的研究方向来分析蛋白质的特点，其中包括：蛋白质的表达水平，翻译后修饰和不同蛋白之间相互作用等，把所有蛋白看成一个整体的蛋白组，从而得到在大规模水平上时某些疾病的产生和细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质既是生物有机体发挥各项生理功能的实施者，也是各种生理疾病情况的直观表现者。研究人员在蛋白质的层面上，来分析逆境胁迫中的植株差异，可以更好地阐明植物的抗逆机制［12］。

冷调控蛋白（COR）、抗冷蛋白（AFP）、冷激蛋白（CSP）、热激蛋白（HSP）和脱水蛋白（DHN）等五大类蛋白是低温诱导蛋白的主要组成部分。这五大类蛋白在系统中主要功能有以下几个方面：①提高细胞耐低温、耐脱水的性能；②在水势较低的时候，保持代谢酶的活性的稳定；③以RNA伴侣蛋白的形式维持RNA结构；④在低温条件下，预防磷脂膜相变；⑤维持质膜的稳定性等［10，13］。

本试验采用分子生物学的手段，分析了低温处理后的西瓜嫁接苗和自根苗之间的蛋白质组学差异，通过研究低温响应差异蛋白及其代谢途径，挖掘与耐低温紧密相关的蛋白（基因），从而揭示嫁接苗耐低温的分子机制，为培育早春设施栽培西瓜新品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及试验处理

采用西瓜（Citrullus lanatus）新品种‘迁丽4号’为接穗，南瓜（Cucurbita moschata）‘京研砧壮’为砧木。选取大小一致的种子于26 ℃催芽，播种到穴盘中，每组设置3个重复。当砧木一叶一心、接穗子叶平展时进行嫁接。培养至三叶一心期后，将对照组西瓜自根苗及嫁接苗进行4 ℃低温胁迫，15 d后取新叶进行蛋白提取、iTRAQ标记和相关数据分析。

1.2 试剂与设备

采用的主要试剂有：BCA试剂盒（Micro biolab公司生产，规格500 mL，货号BCAK-500）、胰蛋白酶（Promega公司生产，规格MS级，货号V5280）、TMT试剂（Pierce公司生产，货号90111）、RIPA裂解液（Thermo Fisher公司生产，规格250 mL，货号89900）、C18 SPE柱（Phenomenex 公司生产，规格10 mg/mL，货号8B-S100-AAK）。

采用的主要仪器设备有：纳升超高效液相色谱（Thermo公司生产，型号EASY-nLC 1200）、四级杆轨道阱质谱（Thermo Scientific公司生产，型号Q-Exactive HFX）、常规高效液相色谱（Shimadzu公司生产，型号LC20AD）。

1.3 蛋白质提取

将叶片用液氮研磨，每个样品0.1 g，放入" 2 mL离心管中，低温备用。在离心管中加入" 1 mL裂解液，置于冰上，脱色摇床上轻轻震荡裂解1～2 h。随后把样品放入离心机，4 ℃、" 12 000 r/min离心15 min，取上清液，备用。

1.4 同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）测序流程

按ROSS等［14］描述的方法将提取的蛋白质进行酶解和iTRAQ标记，采用高效液相色谱对样品进行质谱分析，质谱鉴定工作采用Q-Exactive质谱仪。

1.5 数据分析

对质谱鉴定得到的肽段进行峰识别，之后构建参考数据库，并使用Mascot 2.3.02和Proteome Discoverer 1.4（Thermo）进行进一步的查库鉴定和定量分析。最后利用Uniport和NCBI的数据库［15］对获得的肽段和蛋白质进行分析，采用GO注释及KEGG注释［16］对其功能和代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质鉴定

在所有西瓜苗样品中共鉴定出置信度在95％以上的蛋白质1 829个，用圆点表示每个蛋白，标注在图1中。在鉴定出的1 829个蛋白中，嫁接苗和自根苗差异蛋白有985个（图1中虚线以上绿色和红色的圆点）；非差异蛋白884个（图1中虚线以下灰色的圆点）。其中，以自根苗为对照，嫁接苗中的上调蛋白545个（图1中红色圆点），下调蛋白440个（图1中绿色的圆点）。两样品间表达量倍数差异越大，横坐标绝对值越大；差异表达越显著，纵坐标数值越大，数据的结果越" 可靠。

2.2 差异蛋白功能分析

对获得的差异表达蛋白，采用COG、GO、KEGG和Swissprot等数据库开展蛋白功能注释，每个数据库注释到的蛋白数目不尽相同，最终注释到具有功能性的差异蛋白数量共983个，其中KEGG数据库得到的差异蛋白数目最详尽，见表1。

与其他数据库相比，GO数据库是一个结构化的标准生物学注释系统，适用于各个物种。GO数据库总共有三大类，分别是生物学过程、细胞成分和分子功能，各自描述了基因产物可能行使的分子功能，所处的细胞环境，以及参与的生物学" 过程。

采用GO数据库分析自根苗和嫁接苗的蛋白样本后，共注释到831条差异蛋白，参与了21个生物过程、13个细胞成分和10个分子功能，见图2。差异蛋白在生物过程（代谢过程、细胞增殖、碳固定、氮固定、运动和节律过程）中所占比例较高，均超过60%。上调蛋白质参与碳固定、氮固定、运动及节律过程，下调蛋白参与细胞增殖生物过程。结果表明，组成细胞的差异蛋白质，多数存在于含蛋白的复合物中；在具有分子功能的蛋白中，与催化活性、结构分子活性和转运蛋白活性有关的蛋白占据了较大的比例，尤其值得注意的是，其中具有结构分子活性的分子功能蛋白，表达量" 上调。

2.3 差异蛋白通路分析

根据KEGG中的通路类型，整理嫁接苗和自根苗的差异表达蛋白，如图3所示。被注释到通路上的差异蛋白共有460条，存在一个蛋白在多个通路中重复出现的现象。结果表明，差异蛋白一共参与了87个信号转导通路。其中，涉及的主要代谢通路有：15个碳水化合物代谢途径、14个氨基酸代谢途径、11个脂质代谢途径、6个能量代谢途径、5个其他氨基酸的代谢途径、5个萜类化合物和聚酮化合物的代谢途径、5个辅因子和维生素的代谢途径和6个遗传信息处理的折叠、分类和降解途径。

2.4 目标差异蛋白确定

本研究通过分析所得的差异蛋白，并结合前人研究资料，从嫁接苗和自根苗的差异蛋白中选取17个涉及抗寒性的目标蛋白，见表2。涉及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（磷酸化）活性、NADP结合、谷胱甘肽转移酶活性、ATP结合、跨膜转运蛋白活性等分子功能，葡萄糖代谢过程、糖酵解过程、蛋白质谷胱甘肽化、ATP合成偶联质子转运、蛋白质分解代谢过程等生物过程，以及胞质溶胶、质膜、叶绿体类囊体膜、质子转运ATP合成酶复合物、线粒体、过氧化物酶体膜等细胞" 成分。

３ 讨" 论

西瓜是深受中国人民喜爱的时令水果，在早春时候种植，提早上市，可获得较为理想的经济效益。早春时节，室外温度较低，如果再遭遇倒春寒，经常会导致植株生长受阻、花期授粉不良、果实发育畸形等。在这一系列生命活动的过程中，蛋白质扮演了重要的角色，参与许多生理生化反应，如细胞凋亡、糖酵解反应、信号转导等。嫁接可以提高西瓜的抗寒性，本研究从蛋白组学的角度，阐明了受冷害后西瓜嫁接苗和自根苗之间的差异，具有深远的意义。

本研究通过对自根苗和嫁接苗差异蛋白的丰度分析、GO功能注释和KEGG代谢通路分析，获得了985条差异表达蛋白，其中上调蛋白数目为545，下调蛋白数目为440。最后通过分析获得差异蛋白情况，并结合前人研究成果，挑选17个耐寒相关的目标蛋白。本研究发现冷处理后，与自根苗相比，嫁接苗中的甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达量上升。

在糖酵解反应过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用很重要，目前常用作参照物来研究其他的基因和蛋白。在植物生理功能上，甘油醛-3-磷酸脱氢酶也是意义重大，它不但在能量代谢过程中起到重要作用，还调节许多亚细胞水平上的活动。

越来越多的研究结果证实，在植物体中，GAPDH可以提高植物抗外界压力的能力，在耐干旱、耐盐碱和耐高温等方面发挥重要作用。刘志华等［17］用粗糙脉孢菌和菜豆炭疽病菌的甘油醛3磷酸脱氢酶基因氨基酸序列克隆了球毛壳菌的GAPDH基因的DNA序列，并采用酵母转化子转化GAPDH，并对其进行生物功能分析，结果显示该转化子对Na2CO3和高温具有较高的抵抗力，由此推断，GAPDH确实与植株抗胁迫有关。在细胞质、细胞核间，GAPDH同时参与多种细胞过程。Krynetski等［18］的研究发现，GAPDH能够和其他蛋白结合成DNA-蛋白复合物，从而开启DNA的修复作用，除此以外，Sundararaj等［19］的研究发现，GAPDH可以和端粒进行特异性的结合，在维持端粒的长度和增加DNA的稳定性方面发挥了一定的作用。

本研究还发现冷处理后，嫁接苗的核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco）大链蛋白（蛋白IDCla97C07G134850.1）和小链蛋白（蛋白ID Cla97C05G104530.1）表达量升高。在光合作用碳同化的过程中，核酮糖二磷酸羧化酶是重要双功能酶。它在卡尔文循环中催化CO2的固定，同时还催化O2加在核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）上的反应。赵军等［20］在水稻上的研究和本试验结果基本一致，他们发现在低温胁迫下Rubisco的稳定性及低温胁迫结束后正常生长时，Rubisco活性回复能力提升，采用SDS-PAGE分析表明：低温锻炼增加了大、小亚基的合成量。

在试验过程中发现冷胁迫后，对比自根苗，西瓜嫁接苗中有两组26S蛋白酶体调节亚蛋白表达下调，分别为K03061 PSMC226S（蛋白酶体调节亚单位T1）和K03031 PSMD8（26S蛋白酶体调节亚基N12），这两组蛋白与泛素-26S蛋白酶体系统（ubiquitin-26S proteasome system，UPS）的相关性很高。蛋白质翻译后，UPS是修饰过程中的重要途径，涉及真核生物生长发育，对植物抵抗非生物胁迫及生长发育发挥举足轻重的作用［21］。基因组测序表明，与UPS相关的拟南芥蛋白质的编码基因高达6%以上［22］。有研究表明，在干旱胁迫下，拟南芥中U-box E3泛素连接酶AtPUB18和AtPUB19作为负调节因子参与ABA介导的气孔关闭［23-24］，使得植株对ABA更加敏感，并且抗旱能力大大增强。

但还有一些研究表明，一些非生物胁迫因素，如缺水、金属离子污染、温度过高等可以诱导植物体内的泛素结合酶 E2基因的表达，从而提高植物逆境适应性。Feussner等［25］首次从番茄的cDNA文库中，分离出了E2的蛋白基因，并证实了，在高温和重金属离子的诱导下，该基因的表达极大地提高。由此可以推测，在非生物胁迫下的异常蛋白的降解过程中，E2蛋白扮演了重要角色。也有可能因为热胁迫和冷胁迫温度条件恰好相反，这正印证了本试验的结果，冷害处理后嫁接苗26S蛋白酶体调节亚蛋白表达下调。

目前，研究人已经发现更多的参与植物抗逆过程的UPS家族成员。UPS作为一个庞大的基因家族，至今只有少数的UPS的编码基因的功能被阐明，还有很多基因的作用不明确。另外，泛素化的作用机制、过程，泛素连接酶作用等研究尚少，在植物抗逆过程中，泛素-26S蛋白酶体系统是如何发挥调控作用的，值得进一步深入研究。

4 结" 论

综上所述，本研究对嫁接苗和自根苗进行低温处理，采用TRAQ技术进行蛋白质组学的鉴定和定量分析，然后利用Uniport和NCBI的数据库对获得的肽段和蛋白质进行分析，并采用GO注释及KEGG注释分析其功能和代谢通路，最终获得了差异蛋白985个，其中上调蛋白545个，下调蛋白440个。嫁接苗耐冷性的提高主要与糖酵解过程、光呼吸过程和光合作用关键酶的表达有关。嫁接苗增强了接穗的光合作用能力，从而稳定了其他过程，如生物合成、防御反应和抗性的表达等。通过比较嫁接苗和自根苗在冷胁迫下的蛋白质之间的差异，本研究提供了比较详细的说明，以便更好地理解嫁接赋予西瓜幼苗耐低温特性的机制。

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Proteomics Analysis of Grafted Watermelon Seedlingsunder Low Temperature Stress

MENG Jiali，SHEN Hong，WU Shaojun，YANG Nianfu，YU Xiang and ZHANG Lijie

（Suqian Institute of Agricultural Sciences，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Suqian Jiangsu 223800，China）

Abstract To investigate the changes in protein expression abundance of grafted watermelon seedlings under low temperature stress，and gain deeper understanding of the metabolic pathways involved in the cold tolerance response process during watermelon seedling stage，as well as to explore the relevant molecular regulatory mechanisms，low-temperature treatment was conducted on both grafted and self rooted seedlings for identification and quantitative analysis using iTRAQ technology. Then，the obtained peptides and proteins were analyzed using databases，and their functions and metabolic pathways were annotated using GO and KEGG. In total，985 differential proteins were identified，including 545 upregulated proteins and 440 downregulated proteins." These proteins were categorized into four main groups：carbohydrate metabolism（26.52%），genetic information translation（19.78%），energy metabolism（17.83%），and amino acid metabolism（13.70%）. Proteomics analysis showed that the enhanced low temperature tolerance observed in grafted seedlings was related to the accumulation of Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH） and Ribulose bisphosphate carboxylase（Rubisco） compared to self-rooted seedlings. The results of this study provide a scientific basis for grafting to enhance the cold tolerance of watermelon seedlings.

Key words Low temperature stress; Watermelon; Grafted seedlings; Proteomics

Received "2023-07-28 """Returned 2023-10-12

Foundation item 2021 Natural Science Fund of Suqian Science and Technology Plan（No.K202120）.

First author MENG Jiali，female，master.Research area：new variety breeding and cultivation technology extension in facility agriculture. E-mail：jiali1415118@163.com

Corresponding"" author YU Xiang，male，master，associate research fellow.Research area：vegetable breeding. E-mail：yx003@163.com

（责任编辑：潘学燕 Responsible editor：PAN Xueyan）