鮟鱇鱼肉多肽对小鼠急性毒性试验

摘要：为探讨鮟鱇鱼（Lophius litulon）肉多肽对小鼠的急性毒性作用，将健康的雄性清洁级ICR小鼠18只，随机分为对照组、LPs低剂量组（2.5 g/kg）和LPs高剂量组（10 g/kg）3个组。每只小鼠按20 mL/kg进行灌胃，连续观察14 d，记录小鼠初始体重、第7天体重及第14天体重，观察小鼠的中毒症状以及死亡情况。试验结束后小鼠眼球取血检测其肝肾功能相关指标，取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺观察外观及HE染色后组织结构的变化。结果表明，3组小鼠均未出现死亡，肝肾功能相关指标与对照组相比无显著差异（Pgt;0.05）。LPs高剂量组和LPs低剂量组小鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺等外观正常，HE染色后组织结构清晰，未见到异常变化，鮟鱇鱼肉多肽对小鼠无急性毒性作用。

关键词：鮟鱇鱼（Lophius litulon）；多肽；小鼠；急性毒性

中图分类号：TS209" " " " "文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）12-0135-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.025 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Acute toxicity test of peptides from monkfish meat in mice

SHEN Lu-jia， SHEN Meng-ran， HE Jia-wei， TANG Jing， ZHANG Xi， YANG Zui-su

（Food and Pharmacy College， Zhejiang Ocean University， Zhoushan" 316022， Zhejiang， China）

Abstract：To investigate the acute toxicity of monkfish （Lophius litulon） polypeptides （LPs） in mice， eighteen healthy male ICR mice were randomly divided into three groups： control group， LPs low-dose group （2.5 g/kg）， and LPs high-dose group （10 g/kg）. Each mouse was administered with 20 mL/kg of LPs through gavage， and they were observed continuously for 14 days. The initial weight at the start of the experiment， weight on the 7th day， and weight on the 14th day were recorded." Signs of toxicity and mortality were also observed." At the end of the experiment， blood was collected from the mice’s eyeballs to test for liver and kidney function-related indicators. Heart， liver， kidney， spleen， and lungs were collected for external observation， and the tissues were subjected to HE staining for histological analysis." The results showed that no deaths occurred in any of the three groups of mice. Liver and kidney function-related indicators showed no significant differences compared to the control group （Pgt;0.05）. The heart， liver， kidney， spleen， and lungs of mice in the high-dose and low-dose LPs group appeared normal， and microscopic examination of tissues stained with HE revealed clear structures without abnormal changes. Therefore， Lophius litulon polypeptides had no acute toxicity in mice.

Key words： Lophius litulon；polypeptide；mouse；acute toxicity

收稿日期：2023-09-27

基金项目：浙江省基础公益技术研究计划项目（LGN21D060002）；国家大学生创新创业训练计划项目（202210340028）

作者简介：沈露佳（2002-），女，浙江绍兴人，在读本科生，专业方向为药学，（电话）0580-2260600（电子信箱）shenlujia1029@163.com；通信作者，杨最素（1967-），女，浙江舟山人，教授，硕士，主要从事海洋药物的功效研究，（电话）0580-2260600（电子信箱）yangzs87@163.com。

鮟鱇鱼（Lophius litulon）又名琵琶鱼、结巴鱼、海鬼鱼等，属于脊索动物门（Chordata）脊椎动物亚门鮟鱇目鮟鱇科。鮟鱇鱼主要分布于北太平洋西部海域，在中国沿海区域均有出产，是世界及中国重要经济鱼种［1］，其在营养和药用方面有很高的价值。在日本江户时代，鮟鱇鱼就被视为最高级的贡品，有“东部吃鮟鱇、西部吃河豚”的美誉［2］。鮟鱇鱼作为食品加工原料被加工成新型食品，因其口感风味和营养价值广泛受到人们欢迎［3］。目前，中国正在大力发展鮟鱇鱼食品加工产业，在鮟鱇鱼精深加工方面不断加强开发力度。前期研究发现，鮟鱇鱼肉是富含高蛋白、低脂肪、不饱和脂肪酸及有益矿物元素丰富的优质肉类［4］。以鮟鱇鱼肉为原料，通过酶解方法制备的小于1 ku的鮟鱇鱼肉多肽（Lophius litulon polypeptides，LPs）具有很好的抗氧化活性，LPs可能是生物活性肽的理想来源［5］。LPs通过调节AMPK和Nrf2途径提高肝脏的抗氧化能力，以缓解高脂饲料诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病的进展［6］；同时，LPs通过降低高脂肾损伤小鼠模型的炎症细胞因子水平，调节肠道生态失调，缓解肾脏的脂质毒性［7］。因此，认为LPs具有潜在的药用价值，是值得开发的海洋多肽化合物。有关LPs安全性评价方面的研究鲜见报道，本研究以LPs为原料，以小鼠为试验对象进行急性毒性研究，以期为LPs的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 CF16RXⅡ型高速低温离心机（日本Hitachi公司）；BSA124S型电子天平（德国Satorius AG公司）；SpectraMax M2型多功能酶标仪（Molecular Devices 公司）；RLPHR 1-4LD型冷冻干燥机（德国Christ公司）；Leica切片机（德国莱卡公司）、CX31型光学显微镜及CCD摄像系统（日本Olympus公司）。

1.1.2 试剂 LPs（自制）；天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清总蛋白（TP）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）、甘油三脂（TG）、碱性磷酸酶（ALP）、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.3 试验动物 18只雄性清洁级ICR小鼠购自浙江省实验动物中心，6周龄，体重为22～24 g，小鼠饲养在浙江海洋大学SPF级动物房（SYXK（浙）2019-0031）。控制室温（20～25 ℃）和湿度（40%～45%），受控环境（12 h/12 h 光/暗循环）自由获取无菌水和颗粒饲料。适应性喂养7 d后开始试验。

1.2 方法

1.2.1 LPs的制备 LPs的制备参考文献［5］，鮟鱇鱼肉预处理后匀浆，用95%乙醇溶液脱脂2 h，在料液比1∶5（m/V）、中性蛋白酶（2 000 U/g）条件下45 ℃消化5 h，将水解液煮沸10 min后使酶失活，然后使用超滤膜分离水解液，截获分子质量小于或等于" " 1 ku的多肽液，再利用超滤膜去除游离氨基酸，冷冻干燥得到小于1 ku的鮟鱇鱼肉多肽（LPs），储存在 -20 ℃备用。

1.2.2 LPs对小鼠的急性毒性评估 按照《食品安全性毒理学评估程序和方法》GB 15193.3—2014（中国）进行。禁食4 h后，将18只雄性ICR小鼠随机分为3组：对照组、LPs低剂量组（2.5 g/kg）和LPs高剂量组（10 g/kg），对照组给予相同体积的蒸馏水。每只小鼠按20 mL/kg剂量的LPs混悬液在12 h内经口灌胃。在给药后0.5、1、2、4、6、10 h监测小鼠的一般行为变化。试验期间观察并记录各组小鼠的饮食量、行为精神状态、死亡情况等。

1.2.3 体质量和脏器指数计算 记录小鼠的初始体重、第7天和第14天的体重。给药第14天，小鼠经麻醉后眼球采血，处死解剖后取心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺脏称重，分别计算各脏器的脏器指数，脏器指数=脏器质量/体质量×100%。

1.2.4 血液生化指标测定 小鼠眼球采血后室温下静置1～2 h后12 000 r/mim离心3 min，取上清液

-20 ℃保存。按照试剂盒操作说明书检测AST、ALT、TP、ALP、CRE、BUN、TG和TC的含量。

1.2.5 脏器病理学观察 取小鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏和肺等脏器进行大体形态学观察，分别取1 cm3大小的组织，置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h，采用常规石蜡包埋、5 μm厚度切片、脱蜡至水，以HE染色后中性树胶封片、光学显微镜下观察并拍照。

1.3 数据分析

所有结果均以平均值±标准差（X±SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA），用SPSS 16.0软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重变化及死亡率

试验期间小鼠均自由进食、饮水，未出现拒食现象，试验处理组的小鼠生理状态与对照组相似，无腹泻、倦怠、嗜睡等现象发生，未发现小鼠出现中毒症状或死亡。试验期间小鼠体重均正常增长，如表1所示，LPs低剂量组、LPs高剂量组与对照组相比差异无显著性（Pgt;0.05）。

2.2 小鼠主要脏器指数变化情况

小鼠脏器指数的影响结果如表2所示。LPs低剂量组、LPs高剂量组的心脏、脾脏、肺、肝脏、肾脏脏器指数与对照组相比，均无显著差异（Pgt;0.05），因此，初步判断LPs不会造成小鼠各脏器的病变。

2.3 血液生化指标检测结果

各组别小鼠的血液生化指标检测结果如表3所示。由表3可知，LPs低剂量组、LPs高剂量组中AST、ALT、TP、ALP、CRE、BUN、TG、TC与对照组相比均无显著差异（Pgt;0.05），说明LPs在小鼠的急性毒性试验中不会对小鼠的肝、肾功能造成损伤。

2.4 脏器病理学观察结果

肉眼观察各组别小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的大体结构变化，结果见图1所示。3组小鼠各脏器均未出现明显的肿大、萎缩、出血、充血、水肿、坏死及其他病理改变。各脏器HE染色结果如图2所示。LPs处理组小鼠的心脏结构中心肌细胞呈短柱状，之间有丰富的毛细血管，未见心肌细胞炎症反应和水肿反应。肝脏中肝小叶结构清晰，肝窦和肝索围绕中央静脉排列，肝细胞未见异常变化。脾脏结构完整，白髓与红髓分界清楚，脾索、脾窦及脾内淋巴小结均清晰可见。肺组织中肺内支气管及肺泡结构完整，肺泡腔内未见渗出，肺间质未见明显的炎性细胞浸润。肾皮质内肾小球结构完整，肾小管未见水肿或坏死变化。说明LPs对小鼠的重要脏器无明显的毒副作用。

3 讨论与小结

近年来，从海洋生物及加工副产物中制备生物活性肽已成为研究热点，除了重要的营养价值外，生物活性肽还具有显著的生物活性和药理功能，包括抗氧化、抗炎、抗凝血、免疫调节等，使海洋肽成为设计创新的保肝护肾、抗衰老、免疫增强、降血脂等药物的分子基础［8］。LPs是海洋生物活性肽的一种，可作为慢性病的补充剂或保肝、护肾药物进行研发。

为判断药物是否能进行临床应用必须进行药物临床前安全性评价，对于评估药物临床研究的风险因素和开发价值是重要的参考依据［9］。急性动物毒性试验是判断药物对机体毒副作用的第一步，经观察试验动物发生的各种中毒表现及程度，从而获得药物的半数致死量（LD50）及相关参数［10］。在预试验中无小鼠死亡，故无法计算LPs的LD50，因此采用最大耐受量测定法，观察动物出现的毒性反应［11］。本试验中选择的低剂量组（2.5 g/kg）是一般人群日常使用量（14 mg/kg）的178倍，而高剂量组（10 g/kg）也未引起小鼠的生活状态改变和死亡，且重要脏器的形态结构也未发生变化，因此，LPs对小鼠的半数致死剂量（LD50）gt;10 g/kg，远超过人体的日常使用剂量，说明LPs是安全的，没有毒性作用。

血液学参数的变化是毒性评估的一个具体指标，对机体毒性有很高的预测价值［12，13］。肝脏和肾脏在药物代谢、生物转化和排泄中起重要作用，是药物毒副作用的主要靶器官。药物性的肝肾毒性是目前制约药物开发和临床应用的最大障碍［14，15］。肝肾功能的血液生化指标是作为药物急性毒性评价的重要指标［16］。通过检测与肝功能相关的特异性酶（ALT、AST、ALP）、蛋白质合成能力（TP）及脂质代谢水平（TG、TC）的含量，肾功能相关的（BUN、CRE）水平，发现LPs对肝、肾功能无显著影响，说明LPs没有对小鼠肝、肾健康产生不利影响。

通过观察小鼠的生活状态、脏器指数、脏器形态学及肝肾和血液指标，发现低剂量和高剂量的LPs在试验期间未引起小鼠死亡，形态结构与功能均无显著影响，初步证明了LPs的安全性，后期有必要评价其潜在的致突变性和致畸性，以期为LPs的研发及临床应用奠定基础。

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