棉花黄萎病高效拮抗细菌的筛选及其防治效果

摘要：以棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）为指示菌，采用对峙培养、代谢物抑菌试验筛选高活性生防菌株。通过盆栽试验明确供试菌株的防病效果。结果表明，从棉花根际土壤分离的1 000余株细菌中筛选到162株具有生防效果的菌株，采用平板对峙法进行复筛，最终获得4株综合效果较好的菌株。其中菌株XJ5-6和XJ6-96的抑菌效果较好，抑菌带宽度均超过5.0 mm，抑菌率分别达67.54%和66.86%。盆栽试验结果表明，菌株XJ5-6和XJ6-96混合接种对棉花黄萎病具有较好的防治作用，其防治效果在28 d和40 d分别为32.2%和29.9%，菌株XJ6-96能提高棉花种子的萌发率。

关键词：棉花黄萎病； 根际细菌； 高效拮抗细菌； 抑菌活性

中图分类号：S435.621.2；S476+.19" " " " "文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）12-0067-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.012 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening and control effect of highly effective antagonistic bacteria against cotton verticillium wilt

ZHANG De-zheng1， NIE Tai-li1， YANG Jun2， KE Xing-sheng1， YAN De-peng1， NIE Zhang-qing3， ZHONG Min1

（1.Cash Crops Research Institute of Jiangxi Province， Nanchang" 330000，China；2.Jiangxi Jiangmian Technology Development Co.，Ltd.， Jiujiang 332000，Jiangxi，China；3.Jiangxi Agricultural Technology Promotion Center， Nanchang" 330000， China）

Abstract： Using Verticillium dahliae Kleb as indicator bacteria， the biocontrol strains with high activity were screened by confronation culture and metabolite inhibition test. The preventive effect of the tested strain was determined by pot experiment. The results showed that 162 strains of bacteria with biocontrol effect were screened from more than 1 000 strains isolated from cotton rhizosphere soil， and 4 strains with good comprehensive effect were obtained by using the plate face-off method. Strains XJ5-6 and XJ6-96 showed better inhibitory effects， with the band width exceeding 5.0 mm and the inhibitory rate reaching 67.54% and 66.86%， respectively. The results of pot experiment showed that XJ5-6 and XJ6-96 combined inoculation had a good control effect on verticillium wilt of cotton， and the control effect was 32.2% and 29.9% on 28 and 40 days， respectively. XJ6-96 could improve the germination rate of cotton seed.

Key words： cotton verticillium wilt； rhizosphere bacteria； highly effective antagonistic bacteria； antagonistic activity

收稿日期：2023-11-21

基金项目：江西省棉花产业技术体系资金项目（JXRS-22）

作者简介：张德政（1992-），男，河南太康人，助理研究员，硕士，主要从事土壤微生态研究，（电话）15690606791（电子信箱）zhangdezheng2016@163.com；通信作者，钟 敏（1982-），男，副研究员，博士，（电话）15170290585（电子信箱）327071001@qq.com；聂樟清（1975-），江西丰城人，高级农艺师，（电话）13870620741（电子信箱）nzq.nc@163.com。

棉花黄萎病是棉花生产中重要的土传病害，可以在棉花整个生育期造成危害，能够侵染400多种植物。黄萎病的发生不仅会降低棉花的产量而且对棉花的品质也有很大的影响，如何防治棉花黄萎病成为当前棉花产业所面临的重大问题［1］。然而由于病原菌寄主范围十分广泛、传播途径的多样化和致病机理相对复杂等原因，加上病原菌休眠结构微菌核能够在土壤中存活多年，抗性种质资源以及防治药剂的缺乏，都为黄萎病的防治工作增加了困难［2］。对黄萎病的防治主要是在抗病育种和农业措施的基础上利用化学防治和生物防治等手段。生物防治具有绿色、安全的特点，符合现代农业发展的需求，逐步成为当今社会棉花黄萎病防治工作中的重要举措，利用有益的拮抗微生物防治土传病害在世界范围内已有成熟的应用实践［3］。用于棉花黄萎病防治研究的拮抗微生物主要包括细菌、真菌和放线菌三大类［4］。

根际微生物在维持植株健康方面发挥着重要作用，在20世纪70年代早期，有研究发现根际微生物组构成了土传病原菌侵染的第一道防线［5］。根际微生物组的群落种类结构较复杂，从物种上而言，根际微生物包括细菌、真菌、古菌、放线菌、病毒、原生动物等多种微生物；从数量上而言，细菌占绝对优势，放线菌次之，真菌与其他生物较少。根际细菌由于从植株的根际分离得到，所以一般都与植株的根有亲和力，容易在植物根部定殖，此外根际处微生物活动频繁，更容易获得拮抗性强的细菌，而且大多数细菌属于非专性寄生物，能够人工培养，便于以后在生产上的应用。

棉花黄萎病菌的拮抗细菌主要有芽孢杆菌、棒状杆菌、黄单胞杆菌、荧光假单胞杆菌、叶杆菌属和伯克氏菌属等，其中研究较多的是芽孢杆菌，包括枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌等。大多数拮抗细菌是通过产生挥发性物质影响黄萎病菌菌丝生长来发挥抑制作用［6］。解淀粉芽孢杆菌41B-1分泌产生的伊枯草菌素可以作为抑菌物质，对棉花黄萎病的防效达50%［7］。周京龙等［8］的研究发现对棉花接种植物内生菌后，棉花植株体内的POD和SOD活性均有所提高，进而减轻了棉花黄萎病的发生。拮抗菌X4是从向日葵根际分离出的一种芽孢杆菌，它分泌产生的挥发性物质能够导致黄萎病菌菌丝严重变形［9］。基于拮抗微生物的产品开发将为棉花黄萎病的防控提供有力保障。

1 材料与方法

1.1 材料

在棉花黄萎病的发病高峰期，以紧邻的健康株与病株为研究对象，选取健康植株的根际土样，用于分离根际细菌。

根际细菌分离培养基主要包括营养琼脂培养基（NA），胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），TSA加10 mg/L多黏菌素B，TSA加5 mg/L多黏菌素B和" 10 mg/L萘啶酮酸钠盐，TSA加5 mg/L氯化钠和" " "64 mg/L多黏菌素B，TSA加5 mg/L氯化钠、64 mg /L多黏菌素B和10 mg/L庆大霉素，蛋白胨酵母琼脂，R2A琼脂，黄单胞菌选择性培养基，寡养单胞菌选择性培养基，金氏B培养基加13 mg/L氯霉素和40 mg/L氨苄青霉素，共计11种培养基。

大丽轮枝菌固体培养采用PDA培养基，液体培养采用Czapek液体培养基；供试棉花病原菌为大丽轮枝菌Vd080，由中国农业科学院棉花研究所提供。

1.2 试验地点

试验安排在中国农业科学院棉花研究所，位于河南省安阳县白璧镇的试验农场，棉花种植、管理与常规大田相同，试验过程中不进行病害防治，不使用任何植物生长调节剂。

1.3 棉花根际可培养细菌的分离

健康根际土样进行混合后，为了尽可能多地培养根际细菌，梯度稀释浓度为10-5、10-6、10-7，吸取150 μL悬浮液涂布于11种培养基，每个浓度各涂布4个平板，置于20 ℃培养箱，根据菌落颜色、大小的不同以及菌落边缘形态的差异，经过2、5、7 d后挑取不同的单菌落，平板划线法于原培养基上进行纯化，纯化后的细菌接种于1/10 TSB培养基，于25 ℃ 180 r/min振荡培养后，10 000g离心15 min，去除上清液，加入25%甘油，-80 ℃超低温冰箱保存，待用。

1.4 根际细菌种类鉴定

细菌的DNA没有太多的蛋白质与之结合，易变性而参与PCR反应。分离得到的细菌纯培养以后不经过基因组DNA的提取，稀释以后采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，凝胶电泳对正确的条带进行切胶回收，送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序，测序结果与GenBank数据库中已知序列进行相似性比对分析，相似性最高的作为细菌物种分类的依据。

1.5 拮抗细菌的筛选

1.5.1 孢子萌发试验 大丽轮枝菌Vd080在PDA培养基上培养10 d进行活化，用灭菌的牙签在菌落的边缘挑取少量菌丝，移入Czapeks液体培养基中，150 r/min室温条件下振荡，暗培养6～7 d，用4层无菌纱布过滤除去菌丝，将获得的大丽轮枝菌孢子悬浮液用无菌水稀释到浓度1×107 CFU/mL。

在PDA培养基上均匀涂布400 μL孢子悬浮液，于超净工作台内风干，在距离中心3 cm处滴加5 μL浓度为1×108 CFU/mL的待测细菌悬浮液，筛选产生抑菌圈的拮抗细菌。

1.5.2 平板对峙试验 采用对峙培养法对“1.5.1”中效果较好的拮抗细菌进行进一步拮抗活性筛选，用7 mm的打孔器打取菌饼，将大丽轮枝菌接种于PDA培养基中央，在距离菌饼2 cm处划线接种拮抗细菌，因黄萎病菌大丽轮枝菌Vd080生长较缓慢，试验提前6 d将Vd080转接到PDA培养基上。以不接细菌为对照，每个处理3次重复，在28 ℃的培养箱中培养4～5 d，测量抑菌带大小。

菌落直径=测量菌落直径平均值-7.0 mm

抑菌率=[对照组菌落直径-处理组菌落直径对照组菌落直径]×100%

1.5.3 牛津杯法抑菌试验 将拮抗效果较好的细菌分别接种于含有TSB培养基的试管中，于25 ℃、180 r/min条件下振荡培养36 h后，10 000g离心" " 15 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，在平板中倒入薄薄的一层PDA培养基，将灭过菌的牛津杯放入距平板中心2 cm的位置，再加入适当PDA培养基，冷却后接种大丽轮枝菌Vd080菌饼，25 ℃培养6 d，将上述的发酵液取150 μL加入牛津杯中，每个处理重复3次，培养7～8 d，用游标卡尺测量抑菌圈直径，计算抑菌率。

1.5.4 拮抗细菌对种子发芽的影响 发芽试验选用棉花品种新陆中37，种子提前用70%乙醇溶液浸泡1 min，用2%次氯酸钠浸泡20 min消毒处理，选取" "2株拮抗效果较好的拮抗菌XJ6-96和XJ8-15，放入TSB培养基中摇培，使用其发酵培养液浸泡棉花种子，浓度调整为1×108 CFU/mL，考虑到发酵基质对棉花种子发芽的影响，因此设置基质空白对照，每个处理重复3次，每重复30粒种子，浸种5 h，无菌水将表面冲洗干净后置于平皿催芽，36 h后调查棉花种子的发芽率。

1.5.5 灌根接种法 将2株生防效果较好的拮抗细菌接种于含有TSB培养基的锥形瓶中，于25 ℃、180 r/min条件下培养72 h后，7 000g离心15 min，然后将菌体悬浮于无菌2%的羧甲基纤维素钠（CMC）中，接种前通过稀释平板法调节菌液浓度为1×108 CFU/mL，备用。蛭石和晒干的河沙经过灭菌后，按6∶4混合均匀，混合物装入纸钵（直径6 cm，高10 cm）中，装至距上沿2 cm处。将灭完菌的新陆中37棉花种子浸泡在浓度为1×106 CFU/mL的拮抗细菌悬浮液4 h，晾干。每钵分散播种8粒种子，抚平即可，6钵为1个处理，每处理重复5次。待棉苗的1片真叶平展时进行接种，接菌前进行间苗，拔掉弱苗、小苗，每钵最终保留5株长势一致的棉苗，接菌前1 d不再进行浇水。接菌时将营养纸钵从塑料盆内取出，放置在事先准备好的干净塑料布上，将6.5 cm的纸碟放入塑料盆内，摆放整齐，纸碟内加入10 mL的Vd080孢子悬浮液（1×107 CFU/mL），2 d后处理组分别加入拮抗菌悬浮液10 mL，处理组包括3组，分别是单独接种2株拮抗细菌悬浮液、接种2株拮抗菌悬浮液的混合液、对照组加入10 mL的TSB培养液。

温室湿度维持在60%～75%，环境温度控制在（25±5） ℃，光照良好，浇水要均匀一致，接菌后28、40 d，参照赵丽红等［10］5级分级标准调查发病情况。统计病情指数并计算拮抗细菌对病原菌大丽轮枝菌的防治效果。

病情指数=Σ（各级病株数×相应病级数值）/（调查总株数×4）×100" " （1）

防治效果=（空白对照病情指数-处理病情指数）/空白对照病情指数×100% " （2）

1.6 数据分析

数据用Excel、SPSS 17.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 根际细菌的分离与鉴定

利用11种选择性培养基通过稀释涂布平板法，根据菌落大小以及菌落形态的不同，从2个品种棉花的健康根际分离获得1 236株细菌，分离的细菌经过扩增16S rRNA基因后进行序列比对，去除重复，共得到887种不同种类的细菌，分布在变形菌门、厚壁菌门和水菌门，其中变形菌门占大多数，占比为81.16%。变形菌门中的沙雷氏菌属Serratia和肠杆菌属Enterobacter为分离细菌中的优势属。

2.2 分离细菌对病原菌孢子萌发的影响

通过测定是否有抑菌圈产生，共有162株有较明显的抑菌圈产生，占总分离根际细菌的18.26%，其中有15株的抑菌圈在5 mm以上，能显著抑制大丽轮枝菌孢子的萌发（图1）；选取这15株再进行对峙试验，结果（图2）表明，有12株根际细菌有拮抗效果，其中4株抑菌效果极为明显，抑菌率均在50%以上，分别为XJ3-101、XJ5-6、XJ6-96和XJ8-15，其中XJ5-6的抑菌率达58.66%。

2.3 离体抑菌试验结果

选取“2.2”中4株拮抗效果较好的菌株，利用牛津杯法测定其无菌发酵液对病原菌大丽轮枝菌的拮抗作用。结果（图3、图4）表明，4株菌株对大丽轮枝菌都有不同程度的抑制效果，其中，拮抗细菌XJ5-6、XJ6-96的无菌发酵液对病原菌大丽轮枝菌有较好的抑制作用，抑菌率在50%以上，XJ6-96的抑菌率最高，达66.86%。

2.4 拮抗细菌对棉花种子发芽的影响

从分离得到的拮抗细菌中选择拮抗效果较好的2株XJ6-96和XJ8-15，研究拮抗菌对棉花种子发芽率和芽长的影响。从表1、图5可以看出，与对照相比，拮抗菌XJ6-96显著提高了棉花种子萌发率，对芽长也有促生长作用，促长率达40.30%，而拮抗菌XJ8-15能提高棉花种子的萌发率，但不具有明显的促生长作用。

2.5 拮抗细菌对棉花黄萎病的防治

选取拮抗作用较明显的XJ6-96和XJ5-6拮抗细菌，研究其对棉花黄萎病的防治效果。结果（表2）表明，2株拮抗菌单独接种时，棉花的发病率和病情指数与对照之间无显著差异，在接种后28 d与40 d的调查结果一致，单独接种的防治效果都在10%以下，对病株率的影响不明显，室内有明显拮抗作用的2株细菌对棉花黄萎病并不能发挥作用。

将2株拮抗菌混合接种处理后，与对照相比，棉花黄萎病的病株率和病情指数均明显降低，接菌后28 d和40 d的病株率分别下降了16.9、16.5个百分点，对大丽轮枝菌的防治效果在2个时间段分别为32.2%和29.9%，2株拮抗菌混合接种对棉花黄萎病起到了较好的防治效果（表2）。盆栽试验结果（图6）表明，与对照组相比，拮抗菌混合接种后，棉花植株长势较强，病株数量和发病等级明显下降。

2.6 拮抗细菌XJ5-6和XJ6-96的分子生物学鉴定

提取拮抗细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增，将得到的扩增片段交由华大基因科技股份有限公司（武汉）测序。

测序结果与EZ taxon中的序列比对后，拮抗细菌XJ5-6和XJ6-96与菌株Klebsiella aerogenes strain ATCC 13048（NR 118556.1）和Klebsiella oxytoca strain JCM 1665（NR 112010.1）的同源性分别达99.96%和99.98%，验证可信度分别达89%和94%，确定这2株拮抗细菌为克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.），记为拮抗菌XJ5-6和XJ6-96。

3 讨论与小结

棉花黄萎病生物防治一直是研究的热点，由微生物制成的菌剂或菌肥在大田应用中受环境因素影响较大，病害的发生往往不是单独几种微生物相互作用的结果，仅引入某一种微生物，很难起到很好的效果。利用菌群的方法防治植物病害越来越引起人们的关注，最早在小麦上的研究发现，加入多个假单胞菌属组成的菌群对小麦全蚀病的防治效果比菌株单独使用更好［11］。拟南芥被病原菌侵染后，3株PGPR菌株单独使用对植物无显著影响，但混合使用可以激活一系列反应来防御叶部霜霉病菌（Hyaloperonospora arabidopsidis），并且可以促进植物生长［12］。有研究从烟草根上分离出5株细菌，将其作为混合菌群接种到烟草急性萎蔫病植株上，烟草植株的死亡率与对照相比显著降低，减少了52%，只接种3株混合菌时死亡率减少了36%，但只接种2株混合菌时，对死亡率无影响，有益微生物菌群的引入更加有效地抑制了病害的发生［13］。有益菌群增强植物根际抑病功能的机制可能是微生物菌群的引入增加了可利用微生物资源，它们共同利用一个群落，可以提高生存率，在时间和空间上改善了根际环境［14］。此外，有益微生物存在竞争优势，加剧了与病原菌之间资源的竞争，引起植物免疫防卫反应［15］。再加上生态位宽度的提高可以帮助病原菌在根际定殖，最终起到抑制病原菌的作用［16］。

本研究从棉花植株根际分离得到可培养细菌887株，而大多数的根际细菌不能在现有培养基上生长，还有一部分可能因为生长缓慢而被其他生长较快的菌株所掩盖，从而未被分离，导致无法挖掘到对棉花黄萎病有拮抗作用的生防细菌。本研究结果表明，单独接种1种拮抗菌，对棉花黄萎病的防治效果并不明显，但2种拮抗菌混合接种能够显著降低棉花黄萎病的病株率和病情指数，对病害的防治有很好的效果。XJ5-6和XJ6-96均属于克雷伯氏菌属。克雷伯氏菌属作为根际促生细菌（PGPR），2株克雷伯氏菌能够促进烟草根系对氮和磷的吸收，增加植株的干重，促进了烟草植株的生长［17］；克雷伯氏菌属用于生物防治的研究报道较少，有研究发现，克雷伯氏菌能够诱导烟草植株产生系统性抗性，其代谢产物对软腐病病原菌有显著的抑制作用［18］。

试验初步证明了不同菌株构成的混合菌群在温室条件下发挥作用的可行性，为以后多个微生物因子混合在大田环境中的实际应用提供了依据。拮抗菌XJ5-6和XJ6-96菌株的作用机理尚不明确，根际的定殖能力、发酵培养条件也有待进一步研究。

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