花椒精油成分分析及其对四种植物病原真菌的抗菌作用

摘要：采用索氏提取法制备花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）精油，利用菌丝生长速率法评价花椒精油对尖镰刀菌（Fusarium oxysporum Schltdl）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum Schwabe）、盘长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides Penz. amp; Sacc.）和茄链格孢菌（Alternaria solani）菌丝生长的抑制活性，采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）探究花椒精油的物质组成。结果表明，花椒精油对禾谷镰孢菌、尖镰刀菌、盘长孢状刺盘孢和茄链格孢菌均表现出一定的抗菌活性，半数效应浓度（EC50）分别为1.552、2.243、6.064、7.078 mg/mL。GC-MS分析显示，花椒精油中的主要成分为萜类化合物，包括乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-柠檬烯和桉叶油醇等。

关键词：花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）精油；成分分析；植物病原真菌；抗菌作用

中图分类号：S482.2+92；R284.1" " " " "文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）12-0062-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.011 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Zanthoxylum bungeanum essential oil composition analysis and its antifungal activity on four kinds of plant pathogenic fungi

LI Cheng-zhao1，2， LIU Yu-jie1，2， WANG Wei-feng1，3， MENG Xian-hua1，3， CAO Yong-hong4， SU Qun5，

WANG Jun1，2， YANG Jun-li3

（1.Yantai Zhongke Research Institute of Advanced Materials and Green Chemical Engineering， Yantai" 264000， Shandong，China；2.Shandong Laboratory of Advanced Materials and Green Manufacturing at Yantai，Yantai" 264000， Shandong，China；3.Lanzhou Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province， Lanzhou" 730000，China；4.Zanthoxylum Bungeanum Research Institute， Longnan Economic Forest Research Institute， Longnan" 746000，Gansu，China；5.Baoyuan Bio-Agri Science amp; Technology （Shandong） Co.， Ltd.， Yantai" 264000，Shandong，China）

Abstract： Zanthoxylum bungeanum essential oil was extracted using the Soxhlet method. The effects of Zanthoxylum bungeanum essential oil on Fusarium oxysporum， Fusarium graminearum， Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria solani were evaluated by the mycelial growth rate method. The composition of Zanthoxylum bungeanum essential oil was analyzed using gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The results showed that Zanthoxylum bungeanum essential oil exhibited antifungal activity Fusarium graminiearum， Fusarium oxysporum， Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria solani， with median effect concentration（EC50） of 1.552， 2.243， 6.064， 7.078 mg/mL， respectively. GC-MS analysis revealed that the principal constituents of Zanthoxylum zanthoxylum essential oil were terpenoids including linalyl acetate， linalool， D-limonene and eucalyptol.

Key words： Zanthoxylum bungeanum essential oil； composition analysis； plant pathogenic fungi； antifungal activity

收稿日期：2024-09-12

基金项目：国家自然科学基金项目（32270419）；山东省自然科学基金资助项目（ZR2021MB089；ZR2023MC040）；烟台先进材料与绿色制造山东省实验室项目（E1R03SXM04）；烟台开发区科技领军项目（2022RC005）；陇南市科技计划项目（2022-S˙QKJ-03）

作者简介：李承钊（1997-），男，河南新乡人，硕士，主要从事天然产物化学研究，（电话）19553582293（电子信箱）lichengzhao1997@163.com；通信作者，杨军丽（1983-），山西阳泉人，研究员，博士，主要从事天然产物化学研究，（电子信箱）yangjl@licp.cas.cn；王 君（1991-），山东济南人，助理研究员，博士，主要从事天然产物化学研究，（电话）17863829607（电子信箱）licpwangjun@163.com。

植物病害是为害全球农作物产量和品质的重要因素，每年因植物病害造成的全球农作物减产量高达30%～50%。引起植物病害的病原体主要包括真菌、病毒、细菌、线虫等［1］，其中植物真菌病害占植物病害的70%～80%［2］。茄链格孢菌（Alternaria solani）、尖镰刀菌（Fusarium oxysporum Schltdl）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum Schwabe）、盘长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides Penz. amp; Sacc.）是中国常见的植物病原真菌，尖镰刀菌、禾谷镰孢菌、盘长孢状刺盘孢菌被国际著名期刊《Molecular Plant Pathology》杂志评为分子植物病理学中的十大病原真菌［3］。

茄链格孢菌是早疫病的致病菌，该病原菌主要在作物开花结果期或地下茎块膨大期侵染番茄、马铃薯等经济农作物的茎、叶、果实，可造成农作物减产20%以上，严重时甚至造成农作物绝收，给粮食安全和经济发展造成巨大损失［4，5］。茄链格孢菌主要通过产生细交链格孢菌酮酸（TeA）毒素，诱导活性氧在叶绿体中爆发，引起叶绿体结构破坏，导致大量活性氧扩散到整个细胞中，进一步诱导膜脂过氧化、细胞膜破裂、细胞器解体、细胞核浓缩和DNA断裂，导致细胞死亡和组织坏死，最终杀死植物［6］。禾谷镰孢菌是一种重要的流行性、毁灭性真菌病害，广泛存在于土壤和绿色植物残体上，可侵染小麦、玉米等多种禾谷类作物，诱导赤霉病和根腐病等植物病害的发生，导致粮食作物大幅减产甚至绝收［7］。此外，禾谷镰孢菌在感病子粒中会产生脱氧雪腐镰刀菌烯（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮类（Zearalenone，ZEN）等多种毒素，严重影响食品安全，威胁人畜的生命健康［8］。盘长孢状刺盘孢是炭疽病的主要致病菌，具有寄主范围广泛、危害性强的特点［9］。盘长孢状刺盘孢作为一类半生物营养型真菌病原体，主要采用生物营养和坏死营养的策略感染植物，可侵染农作物的多个部位，特别是接近成熟的果实，仅在农作物采后的储存、运输和销售过程就可造成农作物产量损失40%～80%，严重影响农作物的产量和品质，给粮食安全和经济发展造成巨大损失［10］。尖镰刀菌是枯萎病的致病菌，主要通过引起植物维管的枯萎诱导甜瓜、番茄、棉花和香蕉等作物维管束褐变、发育迟缓、根部腐烂、落叶和植物死亡［11］。

化学防治依然是目前防治植物真菌病害的主要手段。但由于化学杀菌剂的长期不合理使用，导致的“3R”问题（抗性resistance、再增猖獗resurgence、残留residue）越来越不容忽视。因此，寻求和开发新型、高效、绿色的杀菌剂迫在眉睫。植物在不断进化的过程中会产生一些具有抵御病虫害侵扰的次生代谢物质［12］。利用这些具有生物活性的次生代谢产物开发的植物源杀菌剂与传统的化学杀菌剂相比，具有选择性强、作用靶标专一、对非靶标生物相对安全、对环境友好等优点［13］。因此，开发新型植物源杀菌剂对促进农业绿色可持续发展和粮食安全具有重要意义。

植物精油具有显著的抗植物病原菌活性，也是一类抗植物病原菌研究比较广泛的植物提取物，其中萜类化合物被认为是植物精油中起抗菌作用的主要活性物质［14］。花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）精油是植物精油，因其独特的风味和药用价值而受到广泛关注［15-17］。研究表明，花椒精油表现出广谱的抗菌活性，Prieto等［18］的研究发现Zanthoxylum monophyllum、Zanthoxylum fagara和Zanthoxylum rhoifoliu精油对尖镰刀菌具有较强的抑菌活性。Zanthoxylum pseudodumosu精油能够抑制茄链格孢菌的生长［19］，Gong等［20］使用水蒸气蒸馏法对陕西省所产的花椒进行提取，发现花椒精油对15种植物病原菌表现出抗菌活性，鲜见其他省份的花椒精油对植物病原菌抗菌活性的研究。甘肃省是中国花椒的主要产区之一，为了深入探讨甘肃省产花椒资源的生物活性，寻求具有抗植物病原菌作用的植物源活性物质，对甘肃省产花椒的精油进行了提取并对精油的抗植物病原真菌活性进行了初步探究。

1 材料与方法

1.1 植物与病原菌来源

花椒样品于2018年6月采自甘肃省陇南市，由中国科学院兰州化学物理研究所杨军丽研究员鉴定为花椒的果皮。样品（HJ-TS-201806）保存于烟台先进材料与绿色制造山东省实验室。

茄链格孢菌（ACCC 36023）购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，尖镰刀菌（CFCC 7880）、盘长孢状刺盘孢（CFCC 82113）和禾谷镰孢菌（CFCC 50580）购自中国林业微生物保藏管理中心。

1.2 试验仪器

气相色谱质谱联用仪（GC-MS，7890A-5975C型），美国安捷伦科技有限公司；霉菌培养箱（MJL-250型），天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；超净工作台（HVS-1300-U型），苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 花椒精油提取

称取干燥、粉碎的花椒果皮10 g，装入滤纸筒内，将滤纸筒置于索氏提取器抽提筒内，按料液比为1∶13（m/V）加入石油醚，水浴加热，控制加热温度为75 ℃，加热90 min，提取3次，使用旋转蒸发仪将提取液蒸干，得到花椒精油。

1.4 抗植物病原菌活性检测

将花椒精油与二甲基亚砜（含量应低于2.5‰，以避免对试验的影响）混合溶解后，取一定体积与无菌熔融状态马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）混合，将花椒精油的浓度配制为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/mL。将含有花椒精油的PDA置于" "60 mm一次性培养皿（10 mL）中，待培养基凝固后，使用打孔器在培养基上制成6 mm孔洞，接种6 mm试验菌株的菌饼。每个处理重复3次，空白对照组加入除花椒精油外的溶液作为对照。将培养皿置于28 ℃恒温培养箱中，培养6 d后测量各菌落直径，按照式（1）计算抑制率（I）。

[I=（C-d）-（T-d）C-d×100%]" " " "（1）

式中，C为空白对照组平均菌落直径；T为试验组平均菌落直径；d为菌饼直径（6 mm）。

1.5 GC-MS检测

1.5.1 样品预处理 使用二氯甲烷与花椒精油样品按照1∶10（V/V）的比例进行混合，3 000 r/min离心" "5 min后取上清液，并使用0.22 μm微孔滤膜过滤，然后直接上样，进行GC-MS测试。

1.5.2 GC-MS条件设定 色谱柱为HP-5MS型（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；起始温度60 ℃保持nbsp; " " 2 min，以3.5 ℃/min的速度升至180 ℃，以10 ℃/min的速度升至310 ℃保持50 min；气化室温度250 ℃；传输线温度240 ℃；载气为氦气；载气流量1.0 mL/min；分流比50∶1；进样量1 μL。

质谱条件：EI 源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆150 ℃；扫描模式为Scan；扫描质荷比（m/z）为35～500；溶剂延迟3 min。

1.6 数据处理

采用Graphpad Prism 9.5软件处理数据，以浓度的对数值为横坐标、抑制率为纵坐标建立回归曲线，并计算花椒精油对各供试菌种的半数效应浓度（EC50）。

2 结果与分析

2.1 抗植物病原菌活性

采用菌丝生长速率法探究不同浓度的花椒精油对4种植物病原真菌生长的抑制作用，结果（图1、图2、图3）表明，花椒精油对禾谷镰孢菌、尖镰刀菌、盘长孢状刺盘孢和茄链格孢菌的EC50分别为1.515、2.257、5.713、5.912 mg/mL。从EC50结果可以看出，花椒精油对禾谷镰孢菌菌丝生长的抑制作用较强，对茄链格孢菌菌丝生长的抑制作用较弱。

2.2 GC-MS 结果分析

花椒精油进行GC-MS检测的离子流如图4所示，利用NIST（美国国家标准与技术研究院）数据库对保留时间进行检索，从而完成对化合物的定性分析，在数据库中取可信度在90%以上的结果进行汇总，汇总结果如表1所示。结果发现，含量排在前4位的化合物是乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-柠檬烯和桉叶油醇，4种化合物均属于萜类化合物。

3 小结与讨论

本研究结果表明，花椒精油对4种植物病原真菌均有一定的抗菌活性，其中，花椒精油对禾谷镰孢菌生长的抑制作用较强，EC50为1.515 mg/mL，对茄链格孢菌生长的抑制作用较弱，EC50为5.912 mg/mL。采用GC-MS对花椒精油的化学成分进行了分析，结果发现，含量较多的挥发性物质均为萜类化合物，分别是乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-柠檬烯和桉叶油醇。其中芳樟醇、D-柠檬烯、桉叶油醇被报道具有抗植物病原真菌活性［21-23］，柠檬烯也因其具有低毒、低残留等特点被作为植物源农药而越来越受到重视［24］。所以，推测甘肃省产花椒精油中发挥抗植物病原真菌活性的化合物可能是萜类化合物中的乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-柠檬烯和桉叶油醇。本研究制备的花椒精油与报道的利用陕西省产花椒制备的精油相比，两者在抗植物病原菌活性和化学组成上相差较大。从陕西省产花椒中提取的精油对茄子根腐病菌和谷物根腐病菌表现出显著的抗菌活性［20］，虽然其主要化学成分也是萜类化合物（萜品烯-4-醇、1，8-桉叶油素、松油醇、乙酸松油酯等），但具体的物质组成与本研究制备的花椒精油相比差异较大。

不同产地来源的花椒资源由于生长环境的不同，其精油中所含有的化学成分也不尽相同［25］，这也导致了不同产地的花椒对植物病原真菌的抑制作用也有所差异。本研究结果表明，甘肃省产花椒中提取的花椒精油对4种植物病原真菌具有抗菌作用，丰富了花椒精油的生物活性，为植物源农药的开发与研究奠定了基础。下一步将在前期研究基础上进一步探讨花椒精油中发挥抗植物病原真菌作用的活性化合物和作用机制，以期从花椒资源中发现物质基础明确、作用机制清晰的抗植物病原真菌先导化合物，为植物源杀菌剂的研究提供科学支撑和物质保障。

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