鸡传染性法氏囊病毒接种鸡胚成纤维细胞工艺优化

摘 要：鸡传染性法氏囊病是一种急性、高度接触性传染病，主要侵害幼龄鸡。传染性法氏囊病灭活疫苗通常采用强毒接种鸡胚成纤维细胞（CEF）进行病毒的培养。本试验采用细胞培养转瓶培养CEF方法接种病毒对转瓶内细胞接种密度、种毒接种量及收获病毒时间进行了优化，筛选出传染性法氏囊病毒培养的最佳工艺参数（转瓶），为扩大生产稳定的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗奠定了基础。

关键词：鸡传染性法氏囊病毒；鸡胚成纤维细胞；工艺优化

中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2024）07-0031-04

传染性法氏囊病（IBD）是一种急性、高度接触性传染病，主要侵害幼龄鸡。本病主要水平传播，突然发生，传播迅速。2周龄以内的幼鸡感染后，能引起严重的免疫抑制，常诱发继发感染。近年来流行的鸡传染性法氏囊病，超强病毒株致死率高达70%左右，给家禽养殖业带来重大经济损失[1]。

灭活疫苗具有良好的安全性，选择当地流行毒株可以更好地预防本地流行的鸡传染性法氏囊病[2]。目前，制备鸡传染性法氏囊病灭活疫苗的毒株通常为弱毒株或强毒株，采用鸡胚、CEF或传代细胞系（DF⁃1等）进行病毒培养，收获的病毒灭活后，与一定比例的佐剂混合制备成灭活疫苗[3-4]。实际生产中，细胞工艺需要使用大量的SPF鸡胚，费用较高。为降低疫苗成本，现对传染性法氏囊病毒（IBDV）生产工艺进行优化，以提高病毒含量。本试验通过对接种细胞密度、接种剂量和病毒收获时间进行了优化，筛选出制备IBDV的最佳生产工艺，不仅节约了生产成本，还提高了IBDV的病毒含量。

1 "材料与方法

1.1 "材料

M199、胰酶，购于Gibco公司；青链霉素，购于鲁抗公司；新生牛血清，购于内蒙古奥普赛；一次性塑料细胞培养转瓶，购自BIOFIL公司；SPF鸡胚，购自勃林格；种毒IBDV-B株F5代，山东博瑞科生物技术有限公司分离鉴定。

1.2 "方法

1.2.1 "鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备[5] "选择10～11日龄发育良好的SPF鸡胚，蛋壳外表面碘伏喷洒消毒，然后75%酒精进行脱碘消毒，弯头镊子挑破气室内膜，无菌取出鸡胚，置于盛有PBS溶液的平皿中，仔细去除头部和内脏，将胚体移入100 mL小烧杯中，加适量PBS，洗涤胚体2次，尽量去除血细胞，弃去上清液。大剪刀将胚体剪成米粒大小（约1～2 mm）的均匀组织块， PBS溶液冲洗胚体2次后，将剪碎的组织块转移至250 mL三角瓶中，加入0.25%胰酶溶液（约10 mL/胚），置37 ℃水浴中消化30 min，每5 min摇一次。取出三角烧瓶，弃去上清胰酶溶液，直接加PBS溶液洗涤消化后的组织块2次，每次洗涤后均弃去上清液，保留剪碎后的组织块。三角烧瓶中加入适量细胞生长液终止消化，反复吹打数次， 12层纱布滤过；再用适量生长液重悬，反复吹打数次，纱布过滤，混匀细胞悬液，取细胞液200 L，细胞计数。按细胞计数结果，进行适当倍数的稀释。

1.2.2 "最佳接种细胞密度的优化 "见表1将制备的原代鸡胚成纤维细胞（CEF）分别按150万、200万、250万/mL分别接种1 000 mL细胞转瓶，每瓶接种150 mL细胞液，24 h后长成单层。病毒做1 000倍稀释后，接种种毒IBDV-B株病毒液9 mL（接毒比例为细胞培养液的6%）。37 ℃，继续培养72～96 h，每天观察细胞病变，待细胞病变达80%以上时收获病毒液。将收获的病毒液-20 ℃保存，并反复冻融3次，离心取上清液，检测TCID50。

1.2.3 "最佳种毒接种量的优化 "见表2制备的原代鸡胚成纤维细胞（CEF）按照200万/mL的接种密度分别接种3个转瓶，每瓶接种150 mL细胞液，24 h后，长成单层。毒种做1 000稀释后，分别接种IBDV-B株病毒液9 mL（6%）、12 mL（8%）和15 mL（10%）。37 ℃，继续培养72～96 h，每天观察细胞病变，待细胞病变达80%以上时收获病毒液。-20 ℃反复冻融3次，离心取上清液，检测TCID50。

1.2.4 "最佳收获时间的优化 "见表3制备的原代鸡胚成纤维细胞（CEF）按200万/mL分别接种3个转瓶，每瓶接种150 mL细胞液，24 h后，长成单层。接种IBDV-B株病毒液，1000倍稀释后，接种比例8%，每瓶接种12 mL病毒液。37 ℃，继续培养48h 、60 h和72 h，收获病毒液。-20 ℃反复冻融3次，离心取上清液，检测TCID50。

2 "结果

2.1 "鸡胚成纤维细胞制备

共制备原代鸡胚成纤维细胞（CEF）1 000 mL，细胞密度为1 000万/mL。

2.2 "最佳接种细胞密度的优化

接种细胞密度分别为每毫升150万、200万、250万，种毒IBDV-B株接种3个转瓶，培养72 h，病变达80%以上收获。3瓶病毒液无菌检验均符合标准，TCID50测定结果分别为105.78、106.5、106.17，结果见表4。

由表4可见，不是细胞密度越密越好，过高的细胞密度，除了需要接种更多的毒种之外，也可能会产生细胞高密度效应反而抑制病毒生长[6]，因此需要根据毒种的效价及收获时间优化适宜的细胞接种密度。本次试验结果表明，最佳接种细胞密度是200万/mL。

2.3 "最佳种毒接种量的优化

制备鸡胚成纤维细胞液450 mL，细胞接种密度为200万/mL，150 mL/瓶，分装3个转瓶。种毒IBDV-B株接种3个转瓶，接毒剂量分别为9、12 、15 mL，培养72 h，病变达80%以上收获。3瓶病毒液无菌检验均符合标准，TCID50测定结果分别为106.32、106.63、106.17，结果见表5。

由表5可知，不同的种毒接种量对细胞病变的产生有直接影响[7]。当接毒量较小时，病毒达到繁殖高峰的时间延长，细胞整体状态下降，反而不利于病毒增殖，很难出现高毒价。接毒量大了，细胞病变时间提前，病毒增殖快，细胞圆缩脱落，待收获时，病毒死亡较多，所以毒价较低[8]。本次试验结果表明，IBDV的最佳种毒接种量是将毒种1 000倍稀释后，按培养液8%的剂量接种到鸡胚成纤维细胞上。

2.4 "最佳收获时间的优化

制备鸡胚成纤维细胞液450 mL，细胞接种密度为200万/mL，150 mL/瓶，分装3个转瓶。种毒IBDV-B株接种3个转瓶，接毒剂量为12 mL，分别培养48 、72 h和96 h收获。3瓶病毒液无菌检验均符合标准，TCID50测定结果分别为106.17、106.83、105.83，结果见表6。

由表6的试验结果可见，种毒接种单层细胞48 h后产生明显病变，细胞圆缩脱落；60 h时细胞达到80％以上病变，病毒效价最高；72 h时大量细胞从细胞瓶壁脱落，病毒感染后的细胞呈拉网状，病毒效价下降迅速。上述试验结果与张振华等[7]报道的一致。

3 "结论

鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）可在鸡胚成纤维细胞上传代扩繁，本试验从接种细胞密度、种毒接种量和收获时间3个方面进行了工艺优化。试验结果显示，种毒IBDV-B株接种鸡胚成纤维细胞，转瓶培养的最佳生产工艺为接种细胞密度为200万/mL、接种量为毒种1 000倍稀释后培养液的8%、收获时间为60 h、细胞病变80%以上，收获的病毒液中病毒含量最高。

参考文献：

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