基于近红外光谱结合化学计量学的花椒品质快速评价研究

摘要：应用近红外光谱技术结合化学计量学建立花椒代表性成分的定量分析模型。采用紫外可见分光光度法测定不同批次花椒总酰胺和总黄酮含量，并测定挥发油含量。采集50批次花椒样品的近红外光谱，应用Kennard-Stone算法划分样本集。进一步采用偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）和支持向量机（support vector machine，SVM）建立3个指标的含量预测模型，并比较各模型的性能。不同批次花椒样品总酰胺、总黄酮和挥发油含量分别为10.40%～29.09%、10.33%～24.73%、2.72%～8.04%。近红外光谱分别经MSC、SG平滑、SG平滑+MSC预处理后，应用SVM构建的花椒总酰胺、总黄酮和挥发油定量模型准确度较PLSR高，校正集决定系数（RC2）分别为0.818，0.655，0.927，预则集决定系数（RP2）分别为0.898，0.856，0.916。文章所建立的近红外光谱结合PLSR和SVM定量测定模型可以实现花椒类调味品的品质快速评价。

关键词：花椒；近红外光谱；偏最小二乘回归；支持向量机；挥发油

中图分类号：TS201.1""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）10-0147-06

Study on Rapid Evaluation of Zanthoxylum bungeanum Quality Based on

Near Infrared Spectroscopy Combined with Chemometrics

ZHANG Meng-meng1， YANG Xiao-hong1， LI Hai-yang1， GAO Huan-qing1，

LI Yao1， GUO Lun-feng2*

（1.School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China;

2.Pharmacy Department， Ankang Central Hospital， Ankang 725000， China）

Abstract： A quantitative analysis model for the representative components of Z. bungeanum is established using near infrared spectroscopy combined with chemometrics. The content of total amides and total flavonoids of different batches of Z.bungeanum is determined by UV spectrophotometry， and the content of volatile oil is determined. The near infrared spectra of 50 batches of Z. bungeanum samples are collected， and Kennard-Stone algorithm is used to divide the sample set. Furthermore， partial least squares regression （PLSR） and support vector machine （SVM） are applied to establish the content prediction models of the three indexes， and the performance of each model is compared. The content of total amides， total flavonoids and volatile oils in different batches of Z. bungeanum samples is 10.40%～29.09%， 10.33%～24.73%， 2.72%～8.04% respectively. After the pretreatment of near infrared spectroscopy with MSC， SG smoothing， SG smoothing+MSC respectively， the accuracy of the quantitative models of total amides， total flavonoids and volatile oils of Z. bungeanum established by SVM is higher than that of PLSR. The determination coefficients of calibration set （RC2） are 0.818， 0.655， 0.927 respectively， and the determination coefficients of predition set （RP2）" are 0.898， 0.856， 0.916 respectively. The quantitative determination model of near infrared spectroscopy combined with PLSR and SVM established in this paper can achieve rapid evaluation of quality of Z. bungeanum seasonings.

Key words： Zanthoxylum bungeanum; near infrared spectroscopy; partial least squares regression; support vector machine; volatile oil

花椒为芸香科（Rutaceae）花椒属植物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）的成熟果实，具有温中止痛、杀虫、止痒等功效，常用于治疗脘腹冷痛、呕吐、泄泻等脾胃虚寒症状[1]。作为药食同源中药材，花椒不仅是一味温里药，而且是川菜“麻辣鲜香”中“麻”的唯一来源[2]。花椒中富含多种营养活性成分，其中总酰胺、总黄酮和挥发油是花椒的主要活性成分，分别对应花椒“麻辣、色红、芳香”的物质基础，其含量可作为花椒品质评价的重要指标[3-4]。目前针对以上3类成分的含量测定方法多以紫外分光光度法[5]、高效液相色谱法[6]、气相色谱-质谱联用[7]、液相色谱-质谱联用[8]为主，但这些检测方法样品预处理过程繁琐、检测周期耗时长，难以满足大规模生产和快速检测的需求。因此，亟需建立一种简便快速、高效环保的花椒主要成分的含量检测方法来替代传统方法。

近年来，近红外光谱法（near infrared spectroscopy，NIRS）因具有快速、高效、无污染、取样简单且无损等优点已被广泛应用于花椒、生姜粉、川贝母等药食同源中药材的真伪鉴别[9]、产地鉴别[10]和含量检测[11]等方面。课题组前期将便携式NIRS与偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）相结合，建立了判别模型，成功对不同产地花椒挥发油含量、开口率进行了快速测定[12-13]。但仍未见将近红外光谱技术应用于花椒总酰胺、总黄酮和挥发油含量的同时快速测定研究。因此，本研究以花椒为研究对象，采集花椒粉末的近红外光谱，并测定花椒总酰胺、总黄酮和挥发油的含量，进一步采用PLSR和支持向量机（support vector machine，SVM）建立花椒主要成分的含量预测模型，并通过不同预处理方法比较各模型的性能，实验流程见图1。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Antaris Ⅱ型傅里叶变换近红外光谱仪（包括InGaAs检测器、标准石英杯、RESULTTM光谱采集软件和TQ Analyst 9.1分析软件） 美国Thermo Fisher Scientific公司；SP-1920型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；挥发油提取器 四川蜀牛玻璃仪器有限公司；XM-P102H液晶无级调功率超声波清洗机 小美超声仪器（昆山）有限公司；JY-100型高速多功能粉碎机 浙江省永康市象珠松青五金厂。

1.2 实验试剂

羟基-α-山椒素（纯度：98.80%，批号：RP230210）：成都麦德生科技有限公司；芦丁（纯度：98.41%，批号：BCY-000507）：江西佰草源生物科技有限公司；甲醇、乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH（均为市售分析纯试剂）：天津市天力化学试剂有限公司。

1.3 实验样品

50批花椒样品采集于四川汉源、四川茂县、甘肃武都、四川盐源、陕西韩城等花椒主产地，经陕西中医药大学杨冰月副教授鉴定为芸香科植物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）的干燥成熟果实，样品详细信息见表1。将不同产地花椒于高速粉碎机中粉碎，过筛，分别储存于自封袋中，保存于避光处干燥器中，备用。

1.4 实验方法

1.4.1 酰胺类成分含量测定

1.4.1.1 供试品溶液的制备

参考文献[14]，精密称定样品粉末0.3 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，超声处理30 min，放冷，摇匀，过滤，取滤液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，再量取0.2 mL滤液，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容后摇匀，得供试品溶液。

1.4.1.2 对照品溶液的制备

准确称取羟基-α-山椒素对照品，加甲醇制成浓度为7.945 μg/mL的羟基-α-山椒素对照品母液。

1.4.1.3 方法学考察

精密吸取对照品母液，逐级稀释成不同浓度的溶液，即得系列对照品溶液。进样检测，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

取对照品母液连续测定6次，计算精密度；取6份花椒样品制备供试品，测定并计算重复性；取花椒粉末制备供试品溶液，分别在0，0.5，1，2，4，6 h测定吸光度并计算重复性；取6份花椒粉末，精密加入不同对照品溶液后制备供试品溶液，进行加样回收率实验。

1.4.2 黄酮类成分含量测定

1.4.2.1 供试品溶液的制备

参考文献[15]，称取花椒粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，加入60%乙醇30 mL，在超声条件下提取30 min，过滤。取滤液0.2 mL，加入1 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置6 min；随后加入10% NaOH溶液10 mL，用乙醇补至20 mL，摇匀，静置15 min，即得供试品溶液。除不加花椒样品的溶液外，其余均按照上述方法制备，得到空白溶液。

1.4.2.2 对照品溶液的制备

准确称取芦丁对照品，加60%乙醇至刻度，摇匀，得0.2 mg/mL对照品母液。

1.4.3 挥发油的提取

参照《中国药典》（2020年版）四部通则2204挥发油测定法项下甲法测定花椒挥发油得率。准确称取花椒粉末20 g，提取一定时间后，测定挥发油体积，并计算得率（R）：

R（%）=实测挥发油体积（mL）/花椒质量（g）×

100%。

1.4.4 光谱信息采集

取适量样品粉末平铺于石英样品杯中，采集条件：分辨率8 cm-1，扫描波数4 000～10 000 cm-1，总计扫描32次。每个样品重复扫描3次，取其平均谱图作为样品谱图。

1.4.5 数据划分

为消除NIRS样本集划分过程中人员选择时主观因素的影响，利用Kennard-Stone算法将花椒样品按约3∶1的比例随机划分为校正集和预测集[16]。校正集用来建立总酰胺、总黄酮和挥发油的近红外预测模型，预测集用来验证模型的可靠性。

1.4.6 光谱预处理

为消除实验过程中由实验环境、噪音、样品差异等对花椒产地识别产生的无关干扰，对近红外光谱进行多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）、Savitzky-Golay（SG）平滑以及SG平滑+MSC预处理。

1.4.7 模型的建立及评价

1.4.7.1 预测模型的建立

本研究采用PLSR和SVM建立花椒总酰胺、总黄酮和挥发油含量预测模型。应用The Unscrambler X 10.4软件进行PLSR建模。将不同花椒样品校正集光谱矩阵设置为输入值，将酰胺类含量、挥发油含量和黄酮类含量设置为输出值，在最佳光谱预处理方法、最佳主因子数下建立PLSR模型。

采用Matlab_R2014b分析软件，在计算机上进行SVM模型构建。将不同花椒样品校正集光谱矩阵设置为输入值，将酰胺类含量、挥发油含量和黄酮类含量设置为输出值，在最佳光谱预处理方法下建立SVM模型。核函数采用径向基核函数，c和g参数影响拟合精度，通过校正集交叉验证的网格搜索法确定。

1.4.7.2 模型的评价

为验证模型的性能，使用交叉验证的方法。根据校正集决定系数（coefficient of determination of calibration set，RC2）、预测集决定系数（coefficient of determination of prediction set，RP2）、校正均方根误差（root mean squares error of calibration，RMSEC）和预测均方根误差（root mean squares error of prediction，RMSEP）4个参数评价模型效果。当RMSEC、RMSEP接近于0，交叉验证均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV）越小且RC2和RP2越接近于1，表明模型预测效果的稳定性、准确性和预测模型的泛化能力越好。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

由表2可知，总酰胺和总黄酮回归方程的R2≥0.99，表明两个指标的线性关系良好。精密度、重复性、稳定性的RSD均小于3%，平均回收率分别为99.45%和100.39%。结果表明本研究所用紫外分光光度法稳定可靠、重复性好、准确性高，可用于花椒中代表性成分含量的测定。

2.2 不同批次花椒中代表性成分含量

不同产地花椒总酰胺、总黄酮和挥发油含量范围分别为10.40%～29.09%、10.33%～24.73%、2.72%～8.04%（见表3），含量分布范围较广，这与花椒产地密切相关。分析不同产地花椒代表性成分含量发现，汉源花椒三类成分含量均较其他产地高，其均值分别为23.67%、17.93%、7.45%；陕西韩城花椒各成分含量整体较低，其均值分别为14.26%、15.94%、3.14%。

2.3 近红外光谱分析

不同批次花椒样品的近红外平均光谱图见图2中A。不同批次花椒样品之间的近红外光谱图拥有相似的波峰及波谷，光谱吸收强度略有差异。近红外光谱有6处特征峰，分别在4 319.77，4 732.46，5 183.72，5 839.40，6 900.05，8 408.11 cm-1处。其中8 408.11 cm-1附近的吸收峰可能与OH伸缩的第一泛音OH弯曲带组合相关；6 900.05 cm-1附近的吸收峰主要与OH的一级倍频相关；5 839.40 cm-1附近的吸收峰主要归属于CH的一级倍频；5 183.72 cm-1附近的吸收峰主要归属于OH的一级倍频、CO的二级倍频；4 319.77 cm-1附近的吸收峰主要与CH的伸缩振动相关[17-18]。

2.4 PLSR分析

2.4.1 光谱预处理方法的选择

分别采用SG平滑、MSC以及SG平滑+MSC对近红外光谱进行预处理，结果见图2中B～D。以RMSEC、RMSEP、RMSECV、RC2和RP2作为模型的评价指标[19]，结果见表4。与原始光谱相比，经SG平滑预处理光谱后，建立的总酰胺预测模型效果最好，RMSEP最小，为1.369，RP2最大，为0.831；采用MSC处理后建立的挥发油预测模型效果最佳，RMSEP为0.484，RP2为0.896；经SG平滑+MSC处理后，建立的总黄酮预测模型较好，RMSEP为1.208，RP2为0.631。

2.4.2 PLSR模型的建立

经SG平滑、SG平滑+MSC和MSC预处理后的花椒总酰胺、总黄酮和挥发油的PLSR预测结果见图3。在参数优化的基础上，应用PLSR建立的总酰胺预测模型的RP2、RMSEP分别为0.831，1.369；总黄酮为0.631，1.208；挥发油为0.896，0.484。建模样本的指标成分含量预测值和实测值接近，以挥发油的预测效果最佳，总酰胺次之。结果表明，建立的PLSR模型可对花椒的化学成分含量进行预测，且准确性较好，尤其体现在对挥发油和总酰胺含量的预测方面。

2.5 SVM模型的建立

为了能更准确地预测花椒代表性成分的含量，我们进一步建立了SVM机器学习模型，与原始光谱相比，经SG平滑、MSC以及SG平滑+MSC的近红外光谱预处理后，所建立的模型校正和预测性能更佳（见表5）。经MSC预处理光谱后，建立的总酰胺预测模型效果最好，RMSEP和RP2分别为1.088，0.898；挥发油预测模型RMSEP和RP2分别为0.456，0.916；经SG平滑+MSC处理后，总黄酮预测模型RMSEP和RP2分别为0.759，0.839。

由图4可知，SVM建模样本的指标成分含量预测值和实测值接近，以挥发油预测效果最佳，RMSEP为0.456。建立的SVM模型可对花椒总酰胺和总黄酮含量进行更精准的预测，而总黄酮预测效果一般，这与PLSR校正和预测结果基本一致。

3 讨论

作为常用的药食同源食物，花椒品质评价仍多以外观性状评价（色、香、味）、含量测定（总酰胺、总黄酮和挥发油）以及药效评价为主[20-21]。相对而言，含量测定更常见，在测定过程中需使用甲醇等有机试剂对样品进行预处理，操作繁琐，耗时耗力。本研究基于近红外光谱技术建立的花椒总酰胺、总黄酮和挥发油定量测定模型为快速、无损的花椒品质评价提供了一种新的方法。

为拟合花椒近红外光谱与总酰胺、总黄酮和挥发油含量的最佳回归模型，本研究分别采用PLSR和SVM构建定量测定模型，优选定量算法。PLSR是目前近红外光谱分析领域应用较广泛的预测方法，学者们应用PLSR结合NIRS已实现君子仁生物碱含量、橄榄油品质的快速、准确预测[22-23]，这与本研究结果基本一致。然而花椒总黄酮定量模型的校正和预测准确度一般，最佳RC2和RP2分别为0.775和0.637。因此，课题组进一步选择SVM对指标成分含量进行预测。SVM是一种无监督的学习算法，已在当归产地鉴别、枸杞总黄酮、金线莲多糖含量等非线性回归预测方面有广泛应用，尤其在小样本、非线性和高维模式识别问题中具有独特优势[24-26]。同时还可以对异常值进行检测，以提高模型预测的准确性。在本研究中，经过波谱预处理和数据优化后，所建立的SVM模型性能较PLSR均得到明显改善，以挥发油模型效果最好，最佳RC2和RP2分别为0.927和0.916，总酰胺最佳RC2和RP2分别为0.818和0.898，总黄酮最佳RC2和RP2分别为0.655和0.839。综上，本研究所建立的PLSR和SVM模型对于花椒挥发油和总酰胺含量预测效果均较好，以SVM模型性能更优，而总黄酮含量预测准确度相对一般。

花椒黄酮类成分以芦丁、槲皮苷、金丝桃苷等为主，这是花椒“色红”的主要物质基础[27]。本研究在建立总黄酮定量测定模型时，以RMSEC、RMSEP、RP2、RC2参数为评价指标，对近红外光谱的预处理方法以及特征波段（4 000～10 000，6 000～8 000，4 000～6 000 cm-1）进行筛选，结果显示，应用SG平滑+MSC预处理方法以及全波段建立的定量模型中RP2、RC2值相对较高，但预测效果相对于挥发油和总酰胺仍然较差。目前研究者们将近红外光谱与PLSR和SVM结合，已经成功用于连翘中芦丁、黑枸杞和杭白菊中总黄酮等含量的预测，所建立的模型性能均较好[28-30]。因此，针对本研究中SVM和PLSR对花椒中总黄酮含量预测准确度一般的问题，下一步课题组将继续增加不同产地、不同批次花椒样本数据，并进一步优化模型，以提高模型的泛化能力，减少预测误差。

本研究利用近红外光谱结合化学计量学方法，成功构建了花椒总生物碱和挥发油含量的预测模型，以支持向量机建立的模型性能更优，具有较高的准确性和可靠性。后期可进一步增加样本量，优化总黄酮含量预测模型。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2020年版 一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020：166-167.

[2]叶萌.四川花椒产业发展现状及展望[J].中国农村科技， 2020（9）：70-73.

[3]ZHANG M M， WANG J L， ZHU L， et al. Zanthoxylum bungeanum Maxim. （Rutaceae）： a systematic review of its traditional uses， botany， phytochemistry， pharmacology， pharmacokinetics， and toxicology[J].International Journal of Molecular Science，2017，18（10）：2172.

[4]张萌萌，王丹，魏大能，等.基于血清药物化学的花椒温中止痛的质量标志物研究[J].中草药，2022，53（9）：2731-2739.

[5]艾莉，张萌萌，赵容，等.星点设计-响应面法优化花椒主要酰胺类成分提取工艺研究[J].中药与临床，2020，11（6）：13-17，21.

[6]LUO J J， HOU X Y， LI S S， et al. Degradation and transformation mechanisms of numbing substances：hydroxyl-α-sanshool amp; hydroxyl-β-sanshool from Zanthoxylum bungeanum exposed to acid environment[J].Food Chemistry：X，2022，14：100342.

[7]叶洵，刘子博，张婷，等.基于GC-MS结合保留指数法建立花椒挥发油指纹图谱[J].中国调味品，2022，47（4）：68-73.

[8]ZHANG L L， ZHAO L， WANG H Y， et al. The relationship between alkylamide compound content and pungency intensity of Zanthoxylum bungeanum based on sensory evaluation and ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/ mass spectrometry （UPLC-MS/MS） analysis[J].Journal of the Science of Food Agriculture，2019，99（4）：1475-1483.

[9]范林宏，何林，谭超群，等.基于便携式近红外光谱技术快速检测川贝母掺伪问题[J].中国实验方剂学杂志，2022，28（3）：131-138.

[10]CHEN R， LI S Q， CAO H J， et al. Rapid quality evaluation and geographical origin recognition of ginger powder by portable NIRS in tandem with chemometrics[J].Food Chemistry，2024，438（3）：137931.

[11]WU L， GAO Y， REN W C， et al. Rapid determination and origin identification of total polysaccharides contents in Schisandra chinensis by near-infrared spectroscopy[J].Spectrochimica Acta Part A-Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2022，264：120327.

[12]FAN L， HUANG Y， ZHAO R， et al. Geographical-origin discrimination and volatile oil quantitative analysis of Zanthoxylum bungeanum Maxim. with a portable near-infrared spectrometer[J].Analytical Methods，2019，11（41）：5301-5310.

[13]范林宏.基于便携式近红外光谱仪的川贝母及花椒质量快速评价研究[D].成都：成都中医药大学，2021.

[14]齐景梁，高必兴，周娟，等.高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法测定竹叶花椒中2种主要成分的含量[J].中国药业，2021，30（1）：52-56.

[15]陈茜，韦志强，徐晓雪，等.基于CV-ANN技术的花椒色素类成分含量快速无损检测研究[J].中国调味品，2019，44（2）：45-50.

[16]ZENG J Q， ZHOU Z， LIAO Y， et al. System optimisation quantitative model of on-line NIR： a case of Glycyrrhiza uralensis Fisch extraction process[J].Phytochemical Analysis，2020，32（2）：165-171.

[17]刘征辉，魏静娜，赵琳琳，等.近红外光谱技术在金银花和山银花判别中的应用研究[J].中国现代中药，2020，22（1）：58-64.

[18]WEYER L， WORKMAN J.Practical gurde to interpretive near-infrared spectrocropy[M].Boca Raton：CRC Press，2007：62-70.

[19]文元新，祝子喻，陈江，等.基于近红外光谱结合多元分析方法的红花定性定量模型建立及含量差异比较[J].中华中医药学刊，2022，40（8）：200-204，282.

[20]ZHENG T， SUN J Q， SHI X J， et al. Evaluation of climate factors affecting the quality of red huajiao （Zanthoxylum bungeanum Maxim.） based on UPLC-MS/MS and MaxEnt model[J].Food Chemistry：X，2022，16（2）：100522.

[21]ZENG C Y， WEI Q M， PU F L， et al. Discrimination of Zanthoxylum bungeanum Maxim. through volatile aroma compounds analysis with artificial neural network[J].Journal of Food Biochemistry，2021，45（2）：13621.

[22]汪丽娜，张颖，温秀萍，等.基于UHILIC-MS/MS和NIRS法的使君子仁中2个生物碱成分的含量测定研究[J].药物分析杂志，2023，43（6）：999-1011.

[23]REDA R， SAFFAJ T， BOUZIDA I， et al. Optimized variable selection and machine learning models for olive oil quality assessment using portable near infrared spectroscopy[J].Spectrochimica Acta Part A-Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2023，303（2）：123213.

[24]刘玲玲，王游游，杨健，等.基于高光谱技术的枸杞子化学成分含量快速检测技术研究[J].中国中药杂志，2023，48（16）：4328-4336.

[25]王天舒，严辉，胡孔法，等.基于图像结构纹理信息的当归药材产地识别研究[J].中国中药杂志，2021，46（16）：4096-4102.

[26]张勋，黄晓萱，殷金可，等.基于近红外和化学计量学方法对金线莲快速鉴别及其多糖含量测定的研究[J].中国现代应用药学，2023，40（19）：2702-2712.

[27]SUN L W， YU D M， WU Z C， et al. Comparative transcriptome analysis and expression of genes reveal the biosynthesis and accumulation patterns of key flavonoids in different varieties of Zanthoxylum bungeanum leaves[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（48）：13258-13268.

[28]潘秀珍，刘路路，任晓红，等.基于近红外光谱技术建立连翘叶中5种活性成分动态定量模型[J].北京中医药大学学报，2023，46（9）：1280-1290.

[29]ZHANG C， WU W Y， ZHOU L， et al. Developing deep learning based regression approaches for determination of chemical compositions in dry black Goji berries （Lycium ruthenicum Murr.） using near-infrared hyperspectral imaging[J].Food Chemistry，2020，319（7）：126536.

[30]HE J， CHEN L D， CHU B Q， et al. Determination of total polysaccharides and total flavonoids in Chrysanthemum morifolium using near-infrared hyperspectral imaging and multivariate analysis[J].Molecules，2018，23（9）：2395.

收稿日期：2024-05-27

基金项目：陕西省教育厅项目（23JK0413）；陕西省科技厅项目（2024SF-YBXM-483）

作者简介：张萌萌（1993—），女，讲师，博士，研究方向：药食同源中药质量标准。

*通信作者：郭伦锋（1986—），男，副主任药师，研究方向：中药质量标准与中药新药临床。