玫瑰花青素提取工艺优化及其抗疲劳研究

摘要：为优化玫瑰花青素的提取工艺并探究其是否具有抗疲劳作用，该研究以平阴玫瑰为试验材料，通过超声提取法对其花青素进行提取，并通过响应面试验对其超声提取工艺进行优化，最终探索出玫瑰花青素最优的超声提取工艺为酸醇比1.6∶20、料液比1∶16、提取温度50 ℃、提取时间50 min。在小鼠抗疲劳试验中，灌胃玫瑰花青素的小鼠在抗疲劳能力上比对照组的小鼠提升72.5%，而在小鼠血液生化指标的测定中，灌胃玫瑰花青素的小鼠在糖原消耗、乳酸和尿素氮积累等指标上也表现出明显的优势，该研究表明玫瑰花青素对小鼠具有一定的抗疲劳作用。

关键词：玫瑰花青素；响应面法；抗疲劳

中图分类号：TS264.4""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）10-0205-05

Optimization of Extraction Process of Rose Anthocyanins

and Their Anti-Fatigue Study

ZHAO Dong， JIN Cang

（Huanghe University of Science and Technology， Zhengzhou 450063， China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of rose anthocyanins and investigate whether they have anti-fatigue effects， in this study， with Pingyin rose as the test material， its anthocyanins are extracted by ultrasonic extraction method， and the ultrasonic extraction process is optimized through response surface test. Finally， the optimal ultrasonic extraction process for rose anthocyanins is determined as acid-alcohol ratio of 1.6∶20， solid-liquid ratio of 1∶16， extraction temperature of 50 ℃， and extraction time of 50 min. In the anti-fatigue test of mice， the anti-fatigue ability of mice given rose anthocyanins increases by 72.5% compared with that of mice in the control group， and in the determination of blood biochemical indexes of mice， the mice given rose anthocyanins also show obvious advantages in glycogen consumption， lactic acid and urea nitrogen accumulation.This study indicates that rose anthocyanins have" certain anti-fatigue effect on mice.

Key words： rose anthocyanins; response surface methodology; anti-fatigue

花青素又称花色素，在自然界中广泛存在于各种有色的花卉、蔬菜、水果中，作为一种天然的植物化合物，花青素在食品染色和医疗保健等方面受到广泛关注[1-2]。当前研究表明，花青素具有抗氧化、提高视力、改善睡眠、清除自由基等功效[3]，可作为营养强化剂和食品着色剂应用于食品中[4]。

玫瑰为蔷薇科、蔷薇属灌木，原产于我国华北地区以及日本和朝鲜，是一种集观赏与食药用价值于一体的植物[5]。在我国可入药的玫瑰品种主要为平阴玫瑰和苦水玫瑰[6]，目前国内对其利用主要集中在食用和精油的提取方面[7]，对于其花青素的研究相对较少，当前已有研究表明，玫瑰色素粗提取物具有较好的体外抗氧化活性和缓解疲劳的能力[8]。本研究以平阴玫瑰为试验材料，通过响应面法优化玫瑰花青素的超声提取工艺，再通过小鼠试验探究玫瑰花青素的抗疲劳作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

平阴玫瑰：山东华玫生物科技有限公司；健康雄性小鼠：昆明医科大学实验动物学部。

1.2 试剂与仪器

试剂：盐酸、无水乙醇、60%乙醇溶液和矢车菊-3-O-葡萄糖苷。

仪器：电子天平、烘箱、离心机、紫外可见分光光度计和超声波清洗机。

1.3 试验方法

1.3.1 玫瑰花青素的提取

将平阴玫瑰烘干、研磨后过筛，避光保存。根据凌立贞等[9]的研究结果，采用酸醇比为1.6∶20，料液比为1∶16，在49 ℃、800 W的条件下超声提取50 min，随后离心取得的上清液即为玫瑰花青素提取液。

1.3.2 玫瑰花青素标准曲线的绘制

参照李艳秋等[2]的试验方法，以矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品代替花青素标准品，取2 mg矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品溶于0.8%盐酸-乙醇混合溶液中，并定容至10 mL，得到0.2 mg/L的标准溶液。用移液枪分别取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的标准溶液配制成4，6，8，10，12 μg/mL的溶液，以盐酸-乙醇混合液为对照组，使用紫外可见分光光度计在520 nm处测定不同溶液的吸光度，试验重复3次，并绘制标准曲线。

1.3.3 玫瑰花青素得率的测定

取2 g平阴玫瑰粉末，按照试验设计的酸醇比、料液比、提取温度和提取时间研究其对玫瑰花青素提取得率的影响。以盐酸-乙醇混合液为对照组，在520 nm波长处测定提取的玫瑰花青素的吸光度，利用下式计算提取的玫瑰花青素的得率。

花青素得率（%）=标准曲线所得的花青素质量浓度（mg/L）×提取液体积（L）×提取液稀释倍数/[1 000×样品质量（mg）]×100%。

1.3.4 提取工艺优化

1.3.4.1 单因素试验

酸醇比对玫瑰花青素得率的影响试验：精确称取2 g平阴玫瑰粉末，加入20 mL浓度为60%的乙醇溶液。在料液比为1∶16、提取温度为50 ℃、提取时间为50 min的条件下，研究不同的酸醇比（1.0∶20、1.2∶20、1.4∶20、1.6∶20、1.8∶20）对花青素提取得率的影响，每组重复3次。

料液比对玫瑰花青素得率的影响试验：精确称取2 g平阴玫瑰粉末，加入不同体积的60%乙醇溶液。在酸醇比为1.6∶20、提取温度为50 ℃、提取时间为50 min的条件下，研究不同的料液比（1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20）对花青素提取得率的影响，每组重复3次。

提取温度对玫瑰花青素得率的影响试验：精确称取2 g平阴玫瑰粉末，加入20 mL浓度为60%的乙醇溶液。在酸醇比为1.6∶20、料液比为1∶16、提取时间为50 min的条件下，研究不同的提取温度（40，50，60，70，80 ℃）对花青素提取得率的影响，每组重复3次。

提取时间对玫瑰花青素得率的影响试验：精确称取2 g平阴玫瑰粉末，加入20 mL浓度为60%的乙醇溶液。在酸醇比为1.6∶20、料液比为1∶16、提取温度为50 ℃的条件下，研究不同的提取时间（30，40，50，60，70 min）对花青素提取得率的影响，每组重复3次。

1.3.4.2 响应面优化试验设计

在单因素试验结果的基础上，使用Design-Expert 12进行试验设计，选择酸醇比、料液比、提取温度、提取时间为自变量，以玫瑰花青素得率为响应值，设计响应面试验，见表1。

1.3.5 抗疲劳研究

1.3.5.1 转棒试验

将健康的雄性小鼠置于实验室条件下适应一段时间后，将小鼠随机分为两组，每组不少于20只。其中一组每天定时灌胃蒸馏水，另一组每天定时灌胃玫瑰花青素提取液，其他饲养条件一致。连续灌胃10 d 后，将小鼠置于25 r/min的转棒上，按照每天1次、每次10 min的训练强度训练10 d，在10 d内继续灌胃给药，10 d后将小鼠置于15 r/min的转棒上，观察记录小鼠在转棒上运动的时间。

1.3.5.2 生化指标测定

取转棒试验结束后小鼠的眼眶血，将血液在4 ℃下以3 000 r/min离心20 min，分离血清，按试剂盒提取血清中肝糖原（HG）、肌糖原（MG）、乳酸（LA）、尿素氮（BUN）并测定其含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以矢车菊-3-O-葡萄糖苷的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。得到回归方程：y=0.099 4x+0.040 2，R2=0.997 2。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酸醇比对玫瑰花青素得率的影响

固定乙醇的体积，通过不断增加盐酸的含量配制不同的酸醇比，由图2可知，玫瑰花青素得率随着酸醇比的增大而增加，当酸醇比大于1.6∶20时，玫瑰花青素得率下降，因此，提取玫瑰花青素最优的酸醇比为1.6∶20。

2.2.2 料液比对玫瑰花青素得率的影响

乙醇溶液可以起到溶解花青素的作用，在一定范围内，乙醇溶液越多，可溶解的花青素含量越多[10]。由图3可知，料液比在1∶12～1∶16之间时，玫瑰花青素得率呈上升趋势，当料液比大于1∶16时，玫瑰花青素得率逐渐减小，因此，提取玫瑰花青素最优的料液比为1∶16。

2.2.3 提取温度对玫瑰花青素得率的影响

由图4可知，在超声提取过程中，玫瑰花青素得率随着温度的升高呈上升趋势，当温度超过60 ℃时，玫瑰花青素得率呈下降趋势，这可能与花青素在高温下结构不稳定有关[11]，因此在花青素提取过程中要时刻关注温度，避免因为温度过高导致花青素得率降低。

2.2.4 提取时间对玫瑰花青素得率的影响

由图5可知，在50 min内，玫瑰花青素得率随着提取时间的增加而增加，当提取时间超过50 min时，玫瑰花青素的得率急剧下降，这是因为提取时间过短会导致花青素提取不充分，而提取时间过长会导致花青素结构被破坏[12]，因此，超声提取花青素最优的时间为50 min。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 响应面试验模型的建立

根据单因素试验结果，以酸醇比、料液比、提取温度、提取时间为自变量，以玫瑰花青素得率为响应值，利用Design-Expert 12进行响应曲面设计，试验设计方案及结果见表2。

通过自变量与响应值的关系建立回归方程：Y=10.12+0.130 8A－1.234B+0.04C－0.069D+1.022AB+0.256AC－0.123AD－0.37BC+0.53BD－0.356CD－1.53A2－0.78B2－0.31C2－0.527D2，该回归方程的方差分析见表3。

由表3可知，该模型表现出较强的可靠性，回归模型的P值极显著，失拟项的P值不显著，回归方程的决定系数为0.989 5，表明该模型与实际值之间误差较小。此外，除一次项A和交互项BD对花青素得率的影响不显著外，其余项对花青素得率的影响均显著。

2.3.2 响应面试验结果及验证

试验所得的响应曲面图见图6。

由图6可知，4个因素两两交互对玫瑰花青素提取得率均有影响，且各个响应面之间存在差异。

由图6中 a可知，自变量B（料液比）方向的坡度明显大于A（酸醇比）方向的坡度，表明料液比对玫瑰花青素得率的影响大于酸醇比。由图6 中b可知，响应面图呈椭圆形，表明提取温度与酸醇比的交互作用较显著，而提取温度方向的坡度明显陡于酸醇比，故提取温度对玫瑰花青素得率的影响大于酸醇比。由图6中c可知，提取时间对玫瑰花青素得率的影响大于酸醇比。由图6中d可知，提取温度对玫瑰花青素得率的影响大于料液比。由图6中e可知，提取时间对玫瑰花青素得率的影响大于料液比。由图6中f可知，提取温度对玫瑰花青素得率的影响大于提取时间。

通过响应面分析，最终得到玫瑰花青素最佳提取工艺为酸醇比1.6∶20、料液比1∶16、提取温度50 ℃、提取时间50 min，在此条件下玫瑰花青素得率为1.35%。

2.4 抗疲劳试验结果

2.4.1 转棒试验结果

前人的研究表明，小鼠在转棒上停留的时间越长，表明其抗疲劳能力越好[13]。本研究将灌胃蒸馏水的小鼠设为对照组，灌胃玫瑰花青素的小鼠设为试验组进行试验，由表4可知，灌胃玫瑰花青素的小鼠在转棒上停留的时间显著长于对照组，且小鼠在转棒上停留时间的延长率为72.5%。该结果说明玫瑰花青素对小鼠的运动疲劳具有一定的缓解作用。

2.4.2 生化指标测定结果

在运动中，为保证正常的身体机能，身体会将储存的糖原进行分解，从而为机体提供能量，此外，在运动中乳酸和尿素氮的含量也会随着运动时间的延长以及运动强度的增加而增加[14]。因此在抗疲劳试验中，一般会采用测量小鼠血液中的尿素氮、乳酸、糖原等指标检测小鼠的疲劳程度。由表5可知，对对照组和试验组的小鼠进行肝糖原、肌糖原、乳酸、尿素氮含量检测，结果表明，在相同的运动条件下，灌胃玫瑰花青素的小鼠的肝糖原、肌糖原含量显著低于灌胃蒸馏水的小鼠，而乳酸和尿素氮的含量显著低于灌胃蒸馏水的小鼠。

3 讨论与结论

近年来，花青素作为一种天然物质被广泛应用于食品染色和药物研究等方面。本研究以平阴玫瑰为试验材料，在酸醇比、料液比、提取温度、提取时间等方面对其提取工艺进行优化，试验结果表明，4个因素均对玫瑰花青素得率产生影响，影响大小为提取温度＞提取时间＞料液比＞酸醇比。花青素结构具有不稳定的特点，因此在提取花青素过程中需注意避免温度过高和微波时间过长对花青素结构产生破坏。此外，料液比对花青素的提取起着重要作用，只有足够体积的溶剂才可将玫瑰花瓣中的花青素充分溶出。经过本研究的工艺优化，最终确定玫瑰花青素最佳提取工艺为酸醇比1.6∶20、料液比1∶16、提取温度50 ℃、提取时间50 min，在该条件下提取的玫瑰花青素得率最高。

本研究还对玫瑰花青素的抗疲劳作用展开了相关试验，在灌胃小鼠试验中，灌胃玫瑰花青素的小鼠抗疲劳能力明显提升，而在小鼠血液生化指标的测定中，灌胃玫瑰花青素的小鼠在糖原消耗、乳酸和尿素氮积累等指标上也表现出明显的优势。

本研究表明玫瑰花青素在小鼠试验中具有明显的抗疲劳作用，该结论对玫瑰花青素的深入研究提供了一定的科学依据和数据来源。

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收稿日期：2024-06-16

基金项目：2022年度教育部产学合作协同育人项目（220802700230021）；2024年度河南省教育厅人文社会科学课题（2024-ZDJH-524）

作者简介：赵冬（1985—），男，讲师，硕士，研究方向：营养健康。