常压室温等离子体诱变选育耐盐产香酵母菌株

摘要：利用常压室温等离子体（ARTP）技术对鲁氏酵母进行诱变，确定40 s为诱变的最佳时间，此条件下菌株的致死率为98.9%。以耐盐性为指标对诱变后的菌株进行初步筛选，获得一株耐盐性较强的正突变菌株S3-26。将出发菌株及筛选菌株S3-26分别添加到18%盐度的酱醪汁培养基中培养，发酵后进行挥发性风味成分对比分析。研究结果表明，出发菌株S组检出59种风味物质，突变菌株S3-26组检出63种，提高了6.78%。添加S3-26发酵的酱醪汁中醇类、醛类、酸类、酚类、酮类、呋喃类、吡嗪类和总风味物质含量均高于S组，其中醇类含量提高了28.50%，酚类含量提高了80.33%。OAV分析结果表明，S3-26组的典型风味物质含量高于S组，其中苯乙醛提高了45.91%，愈创木酚提高了47.59%，赋予了酱油花香和烟熏香，明显增强了酱油的香气品质。此外，经10次连续传代测试，突变菌株S3-26具有良好的稳定性，综合结果表明选育菌株S3-26具有应用于酱油发酵的潜力。

关键词：鲁氏酵母；常压室温等离子体诱变；耐盐；发酵特性

中图分类号：TS201.3""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）10-0039-04

Breeding of Salt-Tolerant and Aroma-Producing Zygosaccharomyces rouxii

Strains by Atmospheric and Room Temperature Plasma Mutagenesis

MO Fang-hua1， HE Jing2， XING Hao-ran1， TIAN Yu-tong1，

WANG Bing-hui1， WANG Chun-ling1*

（1.College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and Technology，

Tianjin 300457， China; 2.R ＆ D Center， COFCO-Oils Corporation， Beijing 100020， China）

Abstract： Zygosaccharomyces rouxii is mutagenized by atmospheric and room temperature plasma （ARTP） technology. It is determined that 40 s is the optimal mutagenesis time. Under such conditions， the fatality rate of the strain is 98.9%. With salt tolerance as the index， the mutagenized strains are preliminary screened， and a positive mutant strain S3-26 with strong salt tolerance is obtained. The original strain and selected strain S3-26 are added into the sauce mash medium with 18% salinity for cultivation. After fermentation， the comparative analysis of volatile flavor components is conducted. The results show that 59 flavor substances are detected in original strain S group and 63 flavor substances are detected in the mutant strain S3-26 group， increasing by 6.78%. The content of alcohols， aldehydes， acids， phenols， ketones， furans， pyrazines and total flavor substances in the fermented sauce mash added with S3-26 is higher than that of S group， among which， the content of alcohols increases by 28.50%， and the content of phenols increases by 80.33%. The results of OAV analysis show that the content of typical flavor substances in S3-26 group is higher than that in S group， with phenylacetaldehyde content increasing by 45.91% and guaiacol content increasing by 47.59%， giving soy sauce floral and smoky aroma， significantly enhancing the aroma quality of soy sauce. In addition， the mutant strain S3-26 shows good stability after 10 consecutive passage tests， and the comprehensive results show that the selected strain S3-26 has the potential to be applied in soy sauce fermentation.

Key words： Zygosaccharomyces rouxii; atmospheric and room temperature plasma mutagenesis; salt tolerance; fermentation characteristics

酱油是以蛋白质（黄豆、脱脂大豆）、淀粉质（炒小麦、面粉）为主要原料，在多种微生物的共同作用下将原料水解为氨基酸、游离酸等小分子物质，经过复杂的生化反应，从而形成的一种香气浓郁、味道鲜美、兼具一定保健功能的调味品[1-2]，是亚洲地区人们生活中广泛使用的调味料，近年来因其特殊的风味和显著的提鲜作用而远销世界各地[3-4]。

低盐固态工艺和高盐稀态工艺是目前国内外常采用的酱油发酵工艺[5]，随着人们对酱油品质要求的逐渐提高，企业现大多采用高盐稀态发酵工艺以生产品质更优的酱油。高盐稀态工艺在发酵期间可以添加耐盐酵母，酵母不仅可以加快酱油发酵的速度，而且能影响酱油风味物质的形成，在酱油酿造中发挥着重要作用[6]。鲁氏酵母是主要的耐盐酵母之一，常被添加到酱油酿造过程中，是酱油酿造过程中主发酵期的增香酵母，能够产生多种挥发性成分，主要包括醇类、糖醇类、呋喃酮类等，给酱油增添了醇厚的香气[7]。因此，提升酱油风味品质的关键是选育发酵性能优良的耐盐酵母菌种[8]。

紫外诱变和化学诱变等传统诱变手段是目前酵母诱变育种常采用的方法[9]。ARTP诱变育种技术是一种新型的诱变手段，相较于化学诱变和紫外诱变，具有突变性能优越、操作便捷、样品处理快速、安全环保等优点，其技术相对成熟，在细菌、真菌等其他微生物的诱变育种中也得到广泛应用 [10-11]。

本研究将鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）作为出发菌株，采用 ARTP诱变手段对其进行诱变处理，以耐盐性为指标对诱变后的菌株进行初步筛选，再通过突变菌株产香性能、遗传稳定性评价其发酵特性，以期为酱油酿造提供优良菌株，从而提升酱油产品的品质。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：脱脂大豆、炒小麦；菌种：米曲霉沪酿3.042、鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。

1.2 试剂及培养基

YPD液体培养基：北京索莱宝科技有限公司；YPDN培养基：添加不同浓度的NaCl于YPD培养基中；NaCl：天津市风船化学试剂科技有限公司；酱醪汁培养基：称取豆粕120 g，炒小麦80 g，向豆粕中加入适量热水浸泡30 min后拌入炒小麦，121 ℃灭菌20 min。灭菌后将其打散铺平，降温至30 ℃以下，接入成熟种曲0.6 g。于30 ℃培养箱中堆积培养，期间翻曲2次，在第一次翻曲后将大曲平铺培养，42 h时大曲成熟。配制浓度为18%的盐水，将成熟大曲与盐水按1∶2.5的比例混匀，装入发酵罐中，于30 ℃进行发酵，每2～3 d搅拌一次，30 d后结束发酵。酱醪在8 000 r/min、4 ℃下离心10 min收集酱醪汁。

1.3 主要仪器与设备

ARTP常温常压等离子体诱变育种仪 北京思清源生物科技有限公司；BX51光学显微镜 日本SANYO公司；LDZX-75L高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；721型紫外可见分光光度计 （上海）舜宇恒平科学仪器有限公司；全温摇床 苏州培英实验设备有限公司；LRH-250-A生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；GCMS-QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将鲁氏酵母（S）作为出发菌株接种到YPD液体培养基中，于30 ℃振荡培养24 h，将其按2%的接种量接种到YPD液体培养基中，于30 ℃、150 r/min振荡培养至对数期，得到活化菌株。

1.4.2 ARTP诱变条件的确定

用无菌生理盐水洗涤经离心的菌液，重复3次后重悬浮，并将其稀释到菌液浓度为1.0×107个/mL [12]。在无菌金属载片表面点涂10 μＬ上述菌液，随即进行诱变操作。ARTP诱变仪的工作气体采用高纯度（99.999%）氦气（He），设置诱变仪参数，调节载片与工作气体放射口之间的距离为2～3 mm、仪器功率为100 Ｗ、气流量为10 L/min，等离子体射流的温度低于30 ℃，在此操作条件下，ARTP的诱变剂量仅与处理时间有关[13-14]。选择不同时间进行等离子体处理，将处理后的载片用无菌镊子放置于棕色的EP管内，吸取1 mL无菌生理盐水加入其中，涡旋2 min，使菌体完全洗脱至管内[15]。将上述洗脱的菌液避光静置2 h后进行稀释处理，在YPD平板上涂布适量稀释液，于30 ℃倒置培养直至菌落生长。对照组是未经ARTP处理的菌悬液。观察菌株在平板上的生长情况，计算菌落数与致死率。最后绘制致死曲线，横坐标为诱变时间，纵坐标为其对应的致死率 [16]。菌株致死率计算公式如下：

A（%）=（1－BC）×100%。

式中：A为菌株的致死率（%）；B为诱变处理后的平板所生长的菌落数（个）；C为对照组的菌落数（个）。

1.4.3 耐盐性突变菌株的筛选

在最佳诱变条件下对出发菌株进行诱变，分别在含18%、20%、22% NaCl的YPDN平板上涂布100 μL诱变后的菌悬液，30 ℃培养5～7 d，观察菌落生长情况，选出在含盐平板上耐盐性较高的菌落（即长势较好的菌落）扩大培养，并对菌株进行保藏以便后续实验。

将出发菌株和扩大培养的菌株活化后，测OD660 nm值，用YPD液体培养基调整菌液浓度至1.0×107个/mL，再将其梯度稀释至1.0×103个/mL，在含不同浓度NaCl的YPDN平板上分别滴2 μL不同稀释度的菌液，在操作台上晾干后，于30 ℃倒置培养3～5 d后，选取长势较好的菌落进行后续实验。

1.4.4 遗传稳定性验证

制备目的菌株种子液，取2%上述菌液接种至新的YPD液体培养基中，记为菌株传代培养的第1代，之后每隔24 h进行一次接种记为1次传代，连续传代培养10次，并将第1，5，10代培养的菌株分别接种到18%盐度的YPDN液体培养基中，接种量为106个/mL，于摇床中30 ℃ 150 r/min振荡培养5 d，测定OD值及产特征挥发性风味物质含量，以测试目的菌株的产香能力与其遗传稳定性。

1.4.5 突变菌株发酵特性

将鲁氏酵母和目的菌株单菌落活化后，将菌液按接种量106个/mL分别接种到已离心过滤的含盐量为18%的酱醪汁培养基中，在30 ℃ 150 r/min条件下振荡培养。发酵结束后，参考牛亚冰[17]的方法，采用SPME-GC-MS测定酱醪汁的挥发性香气成分，在顶空瓶中加入6 mL酱醪汁，并加入1 g NaCl以及2 μL内标物。将顶空瓶水浴平衡20 min，条件设置为650 r/min、55 ℃。水浴结束后用萃取头吸附30 min，将吸附结束的萃取头推入仪器进样口，解吸25 min，按上述步骤重复测定其他样品。

挥发性风味物质的定性定量分析：将检测得到的质谱图与质谱数据库提供的标准质谱图进行对比，鉴定样品中的风味物质，确定酱油的香气成分，并用面积归一化法对物质进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 ARTP诱变致死率曲线的测定

研究证明，为获得最佳正向突变体，诱变致死率要超过95%，此时可获得最高的正向突变率[18-19]，而且高致死率利于缩小突变文库，有助于高效筛选。

由图1可知，鲁氏酵母（S）的诱变致死率随着诱变时间的增加而上升，当诱变时间为40 s时，S酵母的致死率达到98.9%；而当诱变时间超过40 s时，致死率接近100%。故在其他参数固定的条件下，本实验的最佳诱变时间为40 s。

2.2 耐盐性突变菌株的筛选

在最佳诱变条件下对鲁氏酵母进行诱变，在不同盐度的YPDN培养基上涂布0.1 mL诱变后的菌悬液，选出耐盐度较高的3个菌落扩大培养，分别命名为S3-4、S3-9、S3-26。不同盐浓度下各菌株的生长状况见图2。

由图2可知，低浓度NaCl（0%～12%）胁迫对菌株正常生理功能的影响较小，导致菌株生长情况与对照组相近。当NaCl浓度增加到18%时，其对菌株生长的抑制作用明显增强，菌株正常生长繁殖能力明显下降。但S3-26在18%和20%盐度下生长状况较其他菌株好，其耐盐性有一定程度增强，因此，S3-26是本实验筛选得到的目的菌株，并进行后续实验。

2.3 遗传稳定性验证

应用于工业生产的菌株应具有较稳定的遗传特性，而酵母存在自我修复机制，因此需要对目的菌株S3-26进行遗传稳定性分析。

由图3可知，S3-26在进行第1，5，10次传代后的生物量与其所产的醇类含量略有波动，但基于单因素方差分析结果可知，各代之间的生物量和产醇类物质含量无显著性差异（Pgt;0.05）。此结果验证了筛选得到的S3-26菌株具有良好的稳定性，且具有较高的耐盐性和产香性。

2.4 突变菌株发酵特性

酱油中的挥发性物质为其带来独特的香味，这些挥发性物质种类丰富，是衡量酱油品质的重要指标。已知的酱油中的8类挥发性风味物质超过1 000种，包括醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、酚类、呋喃类、吡嗪类。

分别添加出发菌株S和突变菌株S3-26发酵得到的酱醪汁的挥发性风味物质检测分析结果见图4。

由图4可知，酱醪汁中共检出66种风味物质，S组检出59种风味物质，其中醇类10种、酯类7种、醛类12种、酸类6种、酚类3种、酮类7种、呋喃类3种、吡嗪类11种；S3-26组检出63种、包括12种醇类、8种酯类、12种醛类、7种酸类、4种酚类、7种酮类、2种呋喃类、11种吡嗪类。由此可知，添加S3-26发酵的酱醪汁在风味物质的种类上较S组提高了6.78%。鲁氏酵母是一种典型醇香酵母，在发酵过程中会生成一些特征的高级醇及芳香杂醇，主要有苯乙醇、异戊醇、异丁醇等，S3-26组醇类物质种类比S组提高了20.00%。

酱醪汁中各风味物质相对含量见图5。

由图5可知，醇类、酸类含量在两组发酵的酱醪汁中占比最高，酯类次之，与添加S菌株发酵的酱醪汁相比，添加S3-26菌株发酵的酱醪汁总挥发性物质含量提高了26.39%，并且酱醪汁中除了酯类外，其他7类挥发性物质含量均有所提高，鲁氏酵母作为酱油酿造过程中醇香型酵母，主要形成醇类化合物，含量提高了28.50%，同时，醛类提高了17.62%，酸类提高了26.84%，酚类提高了80.33%，酮类提高了22.29%，呋喃类提高了7.77%，吡嗪类提高了39.61%。

不仅风味物质含量可说明对酱油总体风味的贡献程度，而且有研究表明其气味阈值也具有一定的决定作用 [20]，化合物的OAV＞1表明该物质的相对含量高于阈值，被认为对酱油整体香气的呈现具有贡献作用，并且某种化合物的OAV越大说明其对整体香气的作用越明显[21]，结果见表1。

由表1可知，在添加S和S3-26发酵的酱醪汁中共发现6种OAVgt;1的典型风味物质，其中醇类2种、醛类3种、酚类1种。相比于S组，S3-26组的典型风味物质含量提高了34.29%，除1-辛烯-3-醇外，S3-26组其他典型风味物质组分的含量均高于S组，其中苯乙醇提高了36.06%，2-甲基丁醛提高了1.64%，3-甲硫基丙醛提高了34.77%，苯乙醛提高了45.91%，愈创木酚提高了47.59%，为酱油增添了花香、烟熏香等香气。结合以上耐盐性筛选以及产香能力测定与典型风味物质分析的结果可知，S3-26是可以提升酱油风味品质的目的菌株。

3 结论

酱油酿造的关键环节之一是筛选和培育优质的酵母菌株，为提升酱油香气品质，本研究进行了耐盐产香酱油酵母的选育。以鲁氏酵母为出发菌株，经ARTP诱变及筛选得到一株优良菌株S3-26。对分别添加出发菌株和突变菌株的酱醪汁的挥发性风味物质进行测定及分析，结果表明，添加S3-26发酵的酱醪汁在风味物质的种类上比添加S的酱醪汁提高了6.78%。S3-26组总风味物质含量及醇类、醛类、酸类、酚类、酮类、呋喃类、吡嗪类含量均高于S组，其中醇类物质含量提高了28.50%。结合OAV分析，明确了鲁氏酵母影响酱醪汁风味的6种典型挥发性化合物，其中S3-26组有5种典型挥发性化合物含量高于S组，这些化合物赋予了酱油花香及烟熏香等香气，从而提升了酱油的香气品质。同时，经过连续传代测试，S3-26菌株具有良好的遗传稳定性。本文的研究结果是在酱醪汁模拟发酵条件下得到的，由于酱醪汁发酵与真实酱醪发酵的营养、溶氧等条件不同，还需通过发酵罐放大培养，从而对突变菌株的发酵特性进一步分析，为大规模生产提供参考。

参考文献：

[1]LI J Y， SUN C G， SHEN Z Y， et al. Untargeted metabolomic profiling of Aspergillus sojae 3.495 and Aspergillus oryzae 3.042 fermented soy sauce koji and effect on moromi fermentation flavor[J].LWT-Food Science and Technology，2023，184（1）：115027.

[2]丁婷婷，赵悦，张梦丽，等.不同盐度对酱油发酵中酵母自溶及酱油风味的影响[J].中国调味品，2023，48（7）：14-19.

[3]GAO X L， ZHAO X， HU F， et al. The latest advances on soy sauce research in the past decade： emphasis on the advances in China[J].Food Research International，2023，173（20）：113407.

[4]QI Q， HUANG J， ZHOU R Q， et al.Characterising the mechanism of abating biogenic amines accumulation by cocultures of Zygosaccharomyces rouxii and Tetragenococcus halophilus[J].LWT-Food Science and Technology，2022，164（6）：113672.

[5]LI J Y， ZHANG M L， FENG X J， et al. Characterization of fragrant compounds in different types of high-salt liquid-state fermentation soy sauce from China[J].LWT-Food Science and Technology，2022，169（6）：113993.

[6]彭东，蒋雪薇，陈幽，等.高盐稀态酱醪中耐盐生香酵母的筛选及生香特性研究[J].食品与发酵工业，2020，46（13）：76-84.

[7]刘佳乐.酱油发酵过程强化嗜盐四联球菌对酱油品质的影响[D].无锡：江南大学，2020.

[8]王惠芳.耐盐高核酸酵母ARTP诱变选育及在酱油生产中的应用[D].雅安：四川农业大学，2020.

[9]耿海波，郑辉，张丽媛，等.常压室温等离子体诱变选育耐酸酿酒酵母菌株[J].中国酿造，2022，41（2）：144-148.

[10]张雪，张晓菲，王立言，等.常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展[J].化工学报，2014，65（7）：2666-2684.

[11]LIU T， HUANG Z Y， GUI X， et al. Multi-omics comparative analysis of Streptomyces mutants obtained by iterative atmosphere and room-temperature plasma mutagenesis[J].Frontiers in Microbiology，2020，11：630309.

[12]冯鹏鹏，周钰涵，高杏，等.低产高级醇工业上面发酵酵母的选育[J].食品与发酵工业，2022，48（5）：23-28.

[13]田甜甜.青梅酒酿酒酵母的选育及耐酸机制解析[D].无锡：江南大学，2020.

[14]XIAO B H， HU Y Y， FENG X Q， et al. Breeding of new strains of Gracilariopsis lemaneiformis with high agar content by ARTP mutagenesis and high osmotic pressure screening[J].Marine Biotechnology，2023，25（1）：100-108.

[15]XIN R Y， XIE W C， XU Z Y， et al. Efficient extraction of chitin from shrimp waste by mutagenized strain fermentation using atmospheric and room-temperature plasma[J].International Journal of Biological Macromolecules，2020，155（4）：1561-1568.

[16]付肖蒙，王鹏飞，郝爱丽，等.高耐性酿酒酵母的筛选及其耐受性研究[J].中国酿造，2017，36（10）：23-26.

[17]牛亚冰.三株米曲霉菌种发酵性能的比较[D].天津：天津科技大学，2018.

[18]CAO S， ZHOU X， JIN W B， et al. Improving of lipid productivity of the oleaginous microalgae Chlorella pyrenoidosa via atmospheric and room temperature plasma （ARTP）[J].Bioresource Technology，2017，244：1400-1406.

[19]张雪，吴叶，陈雪雪，等.常压室温等离子诱变筛选高产酯酶的菠萝蜜果酒酿酒酵母[J].食品与发酵工业，2022，48（22）：110-118.

[20]赵苗苗，赵智慧，董建方，等．枸杞酒酿酒酵母的选育及其产香性能分析[J].食品与发酵工业，2022，48（18）：155-161.

[21]赵谋明，蔡宇，冯云子，等.HS-SPME-GC-MS/O联用分析酱油中的香气活性化合物[J].现代食品科技，2014，30（11）：204-212.

[22]赵莹.广式酱油的风味物质与酿造微生物的相关性研究[D].广州：仲恺农业工程学院，2020.

[23]LIU C F， LI Q， NIU C T， et al. The use of atmospheric and room temperature plasma mutagenesis to create a brewing yeast with reduced acetaldehyde production[J].Journal of the Institute of Brewing，2018，124（3）：236-243.

收稿日期：2024-03-28

基金项目：天津市科技计划项目（20ZYJDJC00050）

作者简介：莫芳华（1998—），女，硕士，研究方向：公共卫生与预防医学。

*通信作者：王春玲（1977—），女，教授，博士，研究方向：食品营养与安全。