5-Aza-CdR 对裸鼠皮下移植瘤组织中甲状腺乳头状癌细胞自噬和凋亡的影响及其机制

［摘 要］ 目的：探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷 （5-Aza-CdR） 对裸鼠皮下移植瘤组织中TPC-1细胞自噬和凋亡的影响，并阐明其作用机制。方法：16只BALB/c雌性裸鼠右前腋下接种人甲状腺乳头状癌（PTC） TPC-1 细胞建立移植瘤模型。成瘤后裸鼠随机分为对照组和实验组，每组8 只，对照组裸鼠腹腔注射生理盐水，实验组裸鼠腹腔注射5-Aza-CdR，隔日给药1 次，连续给药4 周。观察2 组裸鼠移植瘤生长情况，末次给药后处死裸鼠，称瘤体质量。HE 染色观察2 组裸鼠移植瘤组织病理形态表现，免疫组织化学染色检测2 组裸鼠移植瘤组织中微管相关蛋白轻链3 （LC3）、B 细胞淋巴瘤-2 （Bcl-2）和Bcl-2 相关X 蛋白（Bax） 蛋白表达水平，实时荧光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法检测2 组裸鼠移植瘤组织中LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、细胞外信号调节激酶激酶（MEK）、细胞外信号调节激酶1 （ERK1）、细胞外信号调节激酶2 （ERK2）、磷酸化ERK1 （p-ERK1）、磷酸化ERK2（p-ERK2） mRNA和蛋白表达水平，并计算Bax/Bcl-2比值。结果：与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤体积和质量明显降低（Plt;0. 01）。对照组裸鼠癌细胞数量多，排列紧密，细胞形状不规则，细胞核染色清晰，细胞核大，细胞有重叠和分叶，可见明显的病理性核分裂象，符合PTC 病理特点；实验组裸鼠癌细胞数目明显减少，排列稀疏，细胞核固缩且胞核不明显，结缔组织明显增多。与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤组织中LC3B 和Beclin-1 mRNA 及蛋白表达水平明显升高（Plt;0. 05），Bax/Bcl-2比值升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），MEK、ERK1/2 及p-ERK1/2 mRNA 和蛋白表达水平明显降低（Plt;0. 05或Plt;0. 01）。 结论：5-Aza-CdR可抑制裸鼠皮下移植瘤组织中TPC-1细胞生长，诱导移植瘤细胞自噬并促进细胞凋亡，其机制可能与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK） /MEK/细胞外信号调节激酶（ERK） 信号通路抑制有关。

［关键词］ 甲状腺乳头状癌； 细胞自噬； 细胞凋亡； 移植瘤； 5-氮杂-2'-脱氧胞苷

［中图分类号］ R736. 1 ［文献标志码］ A

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤和头颈部肿瘤， 其中约80% 为甲状腺乳头状癌（papillarythyroid carcinoma，PTC ） ［1］。迄今为止，甲状腺近全切除术联合放射性碘治疗仍是PTC 患者的最佳初始治疗方案。尽管大多数PTC 患者预后良好，长期生存率较高，但仍有相当比例的PTC 患者出现复发或远处转移， 寻找新的治疗策略有重要意义。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase， MAPK） /丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK） /细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulatedkinase，ERK） 信号通路是所有MAPK 信号转导通路中最重要的信号级联反应， ERK 的表达对细胞生长发育至关重要，其过度激活在癌症的发生发展中起重要作用［2］。PTC 组织中ERK 基因高表达 ［3］。MAPK/MEK/ERK 信号通路还参与细胞凋亡和自噬等多种过程。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡是一种进化上保守的分解代谢过程，可调节细胞生长，维持内环境稳态［4］。自噬异常或减少则不能分解受损的细胞器和蛋白质，导致癌症发生。微管相关蛋白轻链3 （light chain 3， LC3） 和Beclin-1 是自噬途径中的关键蛋白。Beclin-1 是启动自噬体形成的标志，与细胞凋亡中B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2） 家族的抗凋亡蛋白具有相同的BH3 结构域，Bcl-2 既可抑制促凋亡蛋白，又可通过BH3 结构域与Beclin-1 共同调节自噬［5］。

5- 氮杂-2'- 脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR） 是美国食品药品监督管理局批准的DNA 甲基转移酶抑制剂，常用于治疗骨髓增生异常综合征和白血病，最近也用于治疗实体瘤［6］。研究［7-9］ 显示： 5-Aza-CdR 可诱导白血病细胞、肝癌细胞和胆管癌细胞发生凋亡和自噬。目前5-Aza-CdR 对PTC 细胞自噬影响的研究较少， 本研究建立TPC-1 细胞裸鼠移植瘤模型，探讨5-Aza-CdR 是否通过MAPK/MEK/ERK 信号通路影响细胞自噬和凋亡，从而抑制肿瘤生长，为临床PTC 治疗提供依据。

1 材料与方法

1. 1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器 TPC-1细胞株购自上海分子与细胞生物学研究中心。4 周龄BALB/c 雌性裸鼠16 只， 体质量（14. 6±0. 4） g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司， 动物生产许可证号： SCXK （京） 2019-0001。本研究遵循实验动物伦理原则， 在上海分子与细胞生物学研究中心 SPF 级屏障系统中饲养裸鼠， 环境恒温18 ℃ ～22 ℃ ， 恒湿45%～55%， 密闭无菌。5-Aza-CdR （货号HY-A0004） 购自美国Sigma 公司， 兔抗人单克隆LC3B （货号3868）、Beclin-1（货号3495）、MEK （货号8727T）、ERK1/2 （货号4695T） 和磷酸化ERK1/2 （phosphorylatedERK1/2， p-ERK1/2）（货号4370S） 抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase， GAPDH）（货号AF7021） 抗体购自江苏亲科生物研究中心有限公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 标记的山羊抗兔预吸附IgG H ＆ L （bs-0295G-HRP） 二抗和兔抗人β-actin （bs-0061R） 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人Bax （货号40635） 和Bcl-2（货号40639） 抗体购自美国SAB Biotherapeutics 公司。超低温冰箱（-80℃） 和Multiskan FC 酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司，7900HT 实时荧光定量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 系统购自美国应用生物系统公司。

1. 2 TPC-1 细 胞 裸 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型 的 制 备 TPC-1 细胞株采用含10% 胎牛血清的培养基培养，置于含5% CO2的37 ℃培养箱中。倒置显微镜下观察细胞生长情况，隔日更换培养基。待细胞生长至覆盖培养瓶壁的80%～90% 后传代， 取对数生长期细胞，采用胰酶消化细胞，调整细胞浓度为1×107 mL-1， 于裸鼠右前腋下接种， 200 μL/只。接种完毕后将裸鼠置于屏障系统中饲养，待右前腋下出现直径3～5 mm 肿块， 提示移植瘤模型建立成功。

1. 3 动物分组、给药方式和移植瘤生长情况 成瘤后将裸鼠随机分为对照组和实验组，每组各8 只。对照组裸鼠腹腔注射生理盐水（200 μL/只），实验组裸鼠腹腔注射5-Aza-CdR （200 μL/只，1 μg·g-1）， 隔日给药1 次， 周期28 d。给药第0、7、14、21 和28 天采用游标卡尺测量2 组裸鼠瘤体的长径和短径，计算每组裸鼠瘤体长径和短径的平均值并计算移植瘤体积， 移植瘤体积= （长径×短径2） /2， 绘制瘤体体积变化曲线。末次给药后24 h，采用颈椎离断法处死裸鼠，剥离裸鼠肿瘤组织，电子天平称取肿瘤质量，计算2 组裸鼠肿瘤平均质量。取每个瘤体的一部分组织采用石蜡包埋，其余瘤体去除周围结缔组织和血凝块， 置于无酶EP 管中，-80°冰箱保存。

1. 4 HE 染色观察 2组裸鼠移植瘤病理形态表现 将实验组和对照组裸鼠移植瘤组织标本浸泡于4% 多聚甲醛固定液中， 随后进行组织脱水、透明、浸蜡、包埋和切片，再经复水、染色、脱水和封闭，显微镜下观察2 组裸鼠肿瘤组织染色情况并采集图像。

1. 5 RT-qPCR法检测2组裸鼠移植瘤组织中目的基因 mRNA 表达水平 取-80 ℃冰箱冻存的 2组大鼠肿瘤组织40 mg，每个样品加入800 μLTRIzol，提取RNA 并测定RNA 浓度。按照反转录试剂盒操作说明进行反转录生成cDNA。反转录产物按照Magic SYBR Mixture 试剂盒进行RT-qPCR 扩增，检测LC3-Ⅱ 、Beclin-1、Bcl-2、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax）、MEK、ERK1、ERK2 、磷酸化 ERK1 （phosphorylated ERK1，p-ERK1） 和磷酸化 ERK2 （phosphorylated ERK2，p-ERK2） mRNA 表达水平。PCR 反应条件：预变性95 ℃、10 min ；变性95 ℃、15 s；退火60 ℃、60 s，共40 个循环； 总延伸75 ℃ 、5 min。引物序列：LC3-Ⅱ 上游引物序列5 ′-GTCAGCGTCTCCACACCAATCTC-3 ′，LC3-Ⅱ下游引物序列5 ′-ACAA"TTTCATCCCGAACGTCTCCTG-3 ′； Beclin-1上游引物序列5′-ACATCTGGCACAGTGGACAGTTTG-3 ′， Beclin-1 下游引物序列5 ′-AGCATGGAGCAGCAACACAGTC-3 ′；Bax 上游引物序列5 ′-TTCAGGGTTTCATCCAGGATCG-3 ′， Bax下游引物序列5 ′-TTGAGACACTCGCTCAGCTTC-3 ′；Bcl-2 上游引物序列5 ′-CCTGTGGATGACTGAGTACCTG-3′，Bcl-2 下游引物序列5′-GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG-3 ′；MEK 上游引物序列5 ′-TGGAGATGGCAGTTGGAAGAT-3 ′，MEK 下游引物序列5 ′-GAGGTCGGCTATCCATTCCAT-3 ′； ERK1 上游引物序列5 ′-CATCTTCCCTGGCAAGCACTA-3 ′，ERK1下游引物序列5′-AGTTTCGGGCCTTCATGTTG-3′；ERK2 上游引物序列5′-CCTTCCAACCTGCTGCTCAA-3 ′，ERK2 下游引物序列5 ′-TTCTGTCAGGAACCCTGTGTGA-3 ′； p-ERK1 上游引物序列5 ′-TCAAGCCTTCCAACCTC-3 ′， p-ERK1 下游引物序列5 ′-GCAGCCCACAGACCAAA-3 ′； p-ERK2 上游引物序列5 ′-TCCCAAATCTGACTCCAAAG-3 ′，p-ERK2 下游引物序列5 ′-TCCAGCTCCAGTTCAAAGG-3 ′； GAPDH 上游引物序列5 ′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3 ′，GAPDH 下游引物序列5 ′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3 ′。根据所得各组的循环阈值（cycle threshold，CT），以GAPDH 为内参， 采用2-ΔΔCT 法计算目的基因mRNA 表达水平，实验重复3 次。

1. 6 免疫组织化学染色法检测 2组裸鼠移植瘤组织中 LC3B、Bax和 Bcl-2蛋白表达水平 石蜡包埋的甲状腺乳头状癌裸鼠移植瘤组织切成6 μm 厚的切片。切片脱蜡后，采用柠檬酸盐-乙二胺四乙酸进行抗原修复，切片在3% H2O2 中室温孵育5 min抑制内源性过氧化物酶活性。抗原修复后， 采用5% 牛血清白蛋白封闭液在室温封闭切片15 min。分别加入LC3B、Bax 和Bcl-2 一抗（均为1∶ 100稀释）， 室温过夜。次日加入二抗（1∶ 200），37 ℃孵育30 min；采用3，3΄-二氨基联苯胺试剂盒显影，显微镜下观察，蒸馏水终止反应，切片在室温下苏木素染色3 s，梯度乙醇脱水后，二甲苯透明，最后采用中性树胶密封，光学显微镜下观察。所有玻片在同一光源背景强度，同一放大倍数下拍照。采用Image J 图像分析系统进行半定量分析，计算积分吸光度（integrated A，I A）。采用ImageJ 图像分析系统进行半定量分析，计算平均光密度（average optical density， AOD） 值， AOD= 累积光密度（integrated optical density， IOD） 值/目的蛋白分布区域面积。

1. 7 Western blotting法检测 2组裸鼠移植瘤组织中LC3B 、Beclin-1、Bax、Bcl-2、MEK 、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表达水平 -80℃冰箱中取出移植瘤组织，加入放射免疫沉淀法裂解液，在冰上使用玻璃匀浆器匀浆，提取总蛋白，二辛可宁酸蛋白定量法检测蛋白浓度， 加入溴酚蓝和抗氧化剂后100℃煮沸5 min。每孔上样量为20 μg 蛋白， 浓缩胶19 mA，40 min，分离胶29 mA 电泳，待溴酚蓝染料电泳至凝胶底部时停止电泳。采用半干法转膜， 200 mA、90 min， 5% 脱脂奶粉封闭90 min。加入LC3B、Beclin-1、Bax、Bcl-2、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin 和GAPDH 一抗4 ℃ 孵育过夜。第2 天采用Tris 缓冲盐Tween 洗涤缓冲液（Tria-buffered saline with Tween 20， TBST） 洗涤3 次，每次15 min，加入二抗（1∶10 000） 室温孵育90 min， TBST 缓冲液洗涤3 次， 每次15 min。条带置入增强型化学发光试剂中，采用Image J 图像分析系统分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平= 目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复3 次。

1. 8 统计学分析 采用 Graphpad Prism 9. 5 统计软件进行统计学分析。采用Shapiro-Wilk 检验进行正态性检验， 2 组裸鼠移植瘤组织中LC3- Ⅱ 、Beclin-1、Bax、Bcl-2、MEK、ERK1/2 和p-ERK1/2 mRNA 和蛋白及LC3B 蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s 表示，2 组间样本均数比较采用两独立样本t 检验。以Plt;0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 2 组裸鼠移植瘤大体形态、瘤体积和瘤质量 对照组裸鼠移植瘤瘤体呈多结节状，包膜完整，表面呈肉红色，剖面呈鱼肉状，见图1。实验组裸鼠移植瘤体积明显小于对照组（Plt;0. 01），见图2和表1。末次给药后，实验组裸鼠移植瘤质量明显低于对照组（Plt;0. 01），见表1。

2. 2 2组裸鼠移植瘤组织病理形态表现 HE染色结果显示：对照组裸鼠癌细胞数量多，排列紧密，细胞形状不规则，细胞核染色清晰，细胞核大，有重叠和分叶，可见明显病理性核分裂象，符合PTC 病理特点。实验组裸鼠癌细胞数量明显减少，排列稀疏，细胞核固缩且胞核不明显，结缔组织明显增多。见图3。

2. 3 2 组裸鼠移植瘤组织中 LC3- Ⅱ和 Beclin-1mRNA 表达水平及 Bax/Bcl-2 比值 与对照组比较， 实验组裸鼠移植瘤组织中LC3-Ⅱ 和Beclin-1mRNA 表达水平及Bax/Bcl-2 比值明显升高（Plt;0. 05）。见表2。

2. 4 2组裸鼠移植瘤组织中 MEK、ERK1、ERK2、p-ERK1和 p-ERK2 mRNA表达水平 与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤组织中 MEK、ERK1、ERK2、p-ERK1 和p-ERK2 mRNA 表达水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。见表3。

2. 5 2组裸鼠移植瘤组织中 LC3B、Bax和 Bcl-2蛋白表达水平 免疫组织化学染色结果显示：LC3B、Bax 和Bcl-2 蛋白主要在细胞质中表达， 阳性细胞呈棕黄色。与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤组织大部分细胞中LC3B 和Bax 表达呈阳性， LC3B 和Bax 蛋白表达水平明显升高（Plt;0. 05）； Bcl-2 阳性细胞少见， Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（Plt;0. 01）。见图4 和表4。

2. 6 2组裸鼠移植瘤组织中LC3B和Beclin-1蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值 与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤组织中LC3B 和Beclin-1 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比值明显升高（Plt;0. 01）。见图5。

2. 7 2组 裸 鼠 移 植 瘤 组 织 中 MEK、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表达水平 与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤组织中MEK、ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表达水平明显降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。见图6。

3 讨 论

PTC 患者一般预后良好，但是有些PTC 具有高侵袭性和去分化倾向，可能进展为低分化或未分化甲状腺癌， 预后不良［10］， 因此有必要寻找新的疗法。本研究结果显示：随着5-Aza-CdR 给药时间延长，TPC-1 细胞移植瘤生长趋缓，癌细胞数目减少，细胞核出现固缩，表明5-Aza-CdR 可以有效抑制PTC 移植瘤的生长。

5-Aza-CdR 是一种强效且特异性的DNA 甲基转移酶抑制剂，可以重新激活抑癌基因表达，具有良好的抗肿瘤活性［11］。梁等［12］ 和ZHANG 等［13］分别在乳腺癌细胞和膀胱癌细胞中发现5-Aza-CdR可以诱导细胞自噬，发挥抗癌作用。自噬由一组自噬相关蛋白如自噬相关基因5 （autophagy-relatedgene 5，Atg5）、Beclin-1、P62 和LC3 等控制［14-16］。自噬在各种肿瘤类型中频繁下调，表明其作为肿瘤抑制因子。Atg 突变是最常见的自噬介导的致癌因素。Beclin-1 是第一个被发现在癌症中存在突变的Atg 基因， 在77% 卵巢癌和30% 乳腺癌组织中呈单等位基因缺失［17］。本研究结果显示：5-Aza-CdR处理后移植瘤组织中Beclin-1 和LC3B mRNA 和蛋白表达水平明显升高，说明5-Aza-CdR 促进了自噬的表达。

目前临床治疗癌症的手段主要还是通过细胞凋亡消除癌细胞。细胞凋亡是一系列复杂的形态学事件， 如核固缩和核碎裂及质膜的起泡［18］。细胞凋亡途径的任何改变都会导致肿瘤发生［19］。通过内源性或外源性途径诱导癌细胞凋亡已成为许多抗癌治疗策略的关键［20］。QIU 等［21］ 研究显示：在长期微环境应激中， 肝癌细胞出现Beclin-1 的诱导表达， 伴随促凋亡蛋白Bax 的过表达和抗凋亡蛋白Bcl-2 的低表达，促进肝癌细胞的自噬状态向凋亡转变，抑制细胞增殖。本研究结果显示：5-Aza-CdR处理后裸鼠移植瘤组织中Bax 表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，提示5-Aza-CdR 促进了移植瘤内源性细胞凋亡途径的激活。

自噬和凋亡受多种信号通路的调节，MAPK/MEK/ERK 信号通路是其中之一。MAPK/MEK/ERK 信号通路在控制细胞存活和增殖的过程中起重要作用，其异常激活与细胞转化和癌变有关［22］，多种人体肿瘤已检测到该信号通路异常激活［23-24］。本研究结果显示：5-Aza-CdR 处理后移植瘤组织中MEK、ERK1/2 和p-ERK1/2 mRNA 和蛋白表达水平明显降低， 提示5-Aza-CdR 通过抑制MAPK/MEK/ERK 信号通路在诱导PTC 细胞死亡中发挥作用。

综上所述， 5-Aza-CdR 可抑制PTC 生长， 该抑制作用由细胞凋亡和自噬介导，且依赖于MAPK/MEK/ERK 通路下调。本研究结论深化了对5-Aza-CdR 抗肿瘤作用的理解，为将来5-Aza-CdR在治疗PTC 中的临床应用提供了依据。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：石玉宵参与研究设计、实验操作、数据整理、统计分析和论文撰写，刘美岚和朱美霖参与文献检索及论文修改，魏枫参与文章实验设计、论文修改和论文审校。

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