一测多评法同时测定感冒退烧片中4种异黄酮成分

【摘要】目的：建立一测多评法同时测定感冒退烧片中葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量。方法：采用高效液相色谱法，以Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，柱温30 ℃；流动相乙腈-0.4%磷酸，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min；检测波长为250 nm。以葛根素为内标，计算其他3种异黄酮成分的相对校正因子，计算其含量。结果：4种异黄酮成分在各自范围内线性关系良好，各相对校正因子重复性良好，一测多评法所得结果与外标法接近，相对平均偏差＜5.0%。结论：QAMS法方法新颖，简捷准确，节约成本，可用于感冒退烧片的质量控制。

【关键词】一测多评法；感冒退烧片；葛根素；含量测定；相对校正因子

【中图分类号】R284.2

【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）21-0041-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.21.zgmzmjyyzz202421009

Simultaneous Determination of Four isoflavone in Ganmao Tuishao Tablets by QAMS

WANG YingchaoLIAO MinCHEN FengSHU Ke*

Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550081，China

Abstract：Objective To establish a quantitative analysis of multi-components by single-marker（QAMS） method for the simultaneous determination of puerarin，3'-Methoxy Puerarin，Daidzin，Daidzein in Ganmao Tuishao Tablets. Methods HPLC was performed on Agilent Zorbax SB-C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） at 30 ℃；the mobile phase consisted of acetonitrile-0.4% phosphoric acid with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/ min. the detection wavelength was 250 nm.Using puerarin as the internal standard， calculate the relative correction factors of the other three isoflavones and calculate their content.Results The linear relationship of the four components was good in their respective ranges， and the repeatability of the relative correction factors was good. The results of multi-components by single marker method showed good agreement with those of external standard method， the relative mean deviation （RAD） was less than 5.0%.Conclusion QAMS method is novel， simple and accurate， and can be used for the quality control of Ganmao Tuishao Tablets.

Keywords：Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker（QAMS）; Ganmao Tuishao Tablets;Puerarin;Content Assay; Relative Correction Factor

感冒退烧片收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二册，由板蓝根、荆芥穗、拳参、葛根、柴胡等5味中药组成，具有清热散风、解表的功效，用于内热外感风寒引起的四肢酸懒、发热怕冷、鼻流清涕、咳嗽咽痒的治疗^［1］。方中葛根 具有解肌退热、生津止渴的功效^［2］。据研究^［3-4］，葛根药材中含有多种化学成分，主要为多酚、黄酮、异黄酮、氨基酸、微量元素、多糖等。其中葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类成分为其主要活性成分。在感冒退烧片有效成分研究方面，报道有采用气相色谱法同时测定薄荷酮和胡薄荷酮的含量^［5］，采用高效液相色谱法测定葛根素^［6-7］、腺苷^［8］的含量等。由于中药成分复杂，仅以1～2种活性成分或指标进行质量评价已不能满足中药质量控制的要求，因此多指标质控方法已成为评价中药材及其制剂质量的有效手段。在多成分同时测定的质量控制模式中，有效成分对照品是其定量检测的基础和关键所在。但某些对照品存在制备难度大、性质不稳定、价格高昂等问题，使得多指标成分分析受到一定的限制。2006年，王智民等^［7］首次提出一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS），一测多评法是运用一种中药对照品来实现对多个待测组分进行分析的方法，目前，已广泛地用于中药的质量控制，解决了由于对照品缺乏而限制多指标质控技术推广的问题^［9］。

实验采用一测多评法（QAMS），以葛根素为内标，建立3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的相对校正因子，实现一测多评，为测定和评价感冒退烧片的质量提供依据。

1仪器与材料

1.1仪器Thermo U3000型、Agilent 1260型、Waters 2695型高效液相色谱仪；十万分之一和百万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO）；KQ-500DB型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；C18色谱柱（Agilent、Thermo、Waters）。

1.2材料葛根素（批号：110752-201514，中国食品药品检定研究院，含量95.5%）;3^，-甲氧基葛根素（批号：151217，青岛捷士康生物科技有限公司）;大豆苷（批号：150515，青岛捷士康生物科技有限公司）;大豆苷元（批号：111502-200402，中国食品药品检定研究院）。感冒退烧片来源于4家生产企业共计99批次，实验研究期间，样品均在有效期内。乙腈（Tedia Company，lnc）为色谱纯；磷酸（天津市光复化工研究所）、甲醇、乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）均为分析纯，超纯水。

2方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液取葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成浓度分别为0.384 mg/mL、0.320 mg/mL、0.063 mg/mL、0.062 mg/mL的储备液。分别精密吸取葛根素对照品储备液3 mL、3^，-甲氧基葛根素对照品储备液1 mL、大豆苷对照品储备液3 mL、大豆苷元对照品储备液1 mL，置同一25 mL量瓶中，用30%乙醇溶解并稀释至刻度，制成葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元浓度分别为46.08 μg/mL、12.80 μg/mL、7.56 μg/mL、2.48 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液取感冒退烧片10片，糖衣片除去包衣，精密称定，研细，混匀，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3阴性对照溶液按感冒退烧片质量标准规定的处方和工艺，制备缺葛根的阴性对照，再按“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2色谱条件与系统适用性试验Thermo U3000型高效液相色谱仪，Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃；以乙腈为流动相A，0.4 %磷酸为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为250 nm；进样量10 μL。分别精密吸取各溶液适量，进样测定，色谱图可见4种待测成分与相邻色谱峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按所测目标成分计均不低于10000，阴性无干扰。色谱图如图1所示。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系分别精密吸取上述4种成分对照品储备液各1 mL、3 mL、5 mL、15 mL、20 mL，分别置100 mL量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，制成20倍质量浓度差的6个对照品溶液，浓度见表2。按“2.2”项下色谱条件进样分析。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，结果见表3，可见各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.2精密度、重复性和稳定性精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液适量，连续进样6次，记录葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面积，RSD分别为0.16%、0.10%、0.14%、0.88%，表明仪器精密度良好。

取同一批次感冒退烧片样品适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元含量，RSD分别为1.6%、1.6%、1.3%、2.8%，表明该方法重复性良好。

取同一份供试品溶液，于0 h、6 h、10 h、12 h、18 h、24 h测定，记录葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面积，RSD分别为0.06%、0.12%、0.31%、2.19%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3加样回收率取已知指标成分含量的同一批感冒退烧片样品适量（葛根素10.5570 mg/g、3^，-甲氧基葛根素2.4395 mg/g、大豆苷1.9413 mg/g、大豆苷元0.4428 mg/g），研细，混匀，精密称取6份，每份50 mg，置于具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液（葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元浓度分别为0.0263 mg/mL、0.00556 mg/mL、0.00356 mg/mL、0.00140 mg/mL）25 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定，计算回收率。结果见表4。

2.4相对校正因子测定取“2.3.1”项下对照品溶液适量，测定，以葛根素为内标，测定其他3种成分相对校正因子fsi，fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）=（As·Ci）/（Ai·Cs），式中As为内标峰面积、Ai为其他组分峰面积、Cs内标浓度，Ci为其他组分浓度。结果见表5。考察不同色谱柱、仪器、流速等对相对校正因子的影响，结果均无明显影响（RSD＜5.0%）。结果见表6。

2.5相对保留时间测定本实验以葛根素为内标，采用相对保留值法（待测成分与内标保留时间之比）对其他成分色谱峰进行定位。结果见表7。

2.6一测多评法与外标法含量测定结果比较取15批感冒退烧片样品，以拟定方法对样品进行测定，以葛根素为S峰，其余3个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量，得到结果与外标法测定结果比较，测定结果见表8。由此可知，两种方法所得结果接近，相对平均偏差＜5%，表明一测多评法可用于本实验含量测定。

2.7样品含量测定采用一测多评法测定4个厂家共99批次样品，葛根4个成分全部检出，含量测定结果以葛根素（C21H20O9）、3^，-甲氧基葛根素（C22H22O10）、大豆苷（C21H20O9）、大豆苷元（C15H10O4）的总量计，结果见表9，可见各生产企业检测指标质量水平相差较大。采用SPSS 23.0 统计软件对不同企业间含量测定结果进行分析，绘制各企业含量测定值箱式图（如图2），可见不同生产企业中位数相差较大，数据离散。A企业含量测定的均值最高，且该企业批间差异较小，说明该企业不同批次的原料和生产工艺都较稳定；B企业数据出现离散，最大值和最小值相差较大；C企业葛根含量测定的均值最低，且数据出现离散，出现最小值。D企业批间差异最大，最大值为最小值的2.4倍。

3讨论

3.1内标物及指标成分的选择关于葛根化学成分研究^［10-12］概况，葛根中主要有效成分是异黄酮类化合物以及少量的黄酮类物质，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元、3^，-甲氧基葛根素、3^，-羟基葛根素等30余种，除了主要成分异黄酮外，还有三萜类及甾体类化合物，香豆素类及葛酚苷类化合物，在葛根的有效成分中，葛根素、大豆苷、大豆苷元等成分具有防治头痛、抗氧化、抗癌、抗炎、解热等作用，本实验选择葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元4种成分为指标成分。

3.2供试品提取溶剂和提取方法的选择实验考察了以甲醇、80%甲醇、60%甲醇、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇为溶剂进行供试品的制备，结果30%乙醇为提取溶剂时，4个成分的含量总量较高，故选取30%乙醇为提取溶剂。考察了采用回流和超声方式进行提取，结果回流与超声提取含量值相差较小，故选取便捷、易操作的超声作为供试品的提取方法。

研究以葛根素为内标物，采用QAMS同时测定感冒退烧片中葛根素、3^，-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量，同时比较QAMS与外标法计算15批感冒退烧片中待测成分的含量，相对平均偏差均小于5%，表明该方法可用于感冒退烧片中4种异黄酮成分含量测定，可为提升感冒退烧片的质量标准，确保该制剂的质量控制提供依据。

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（收稿日期：2023-04-21编辑：陶希睿）