长基因间非蛋白编码RNA 472对阿尔茨海默病神经元铁死亡的作用机制研究

【摘要】目的 探究长基因间非蛋白编码RNA 472（LINC00472）对阿尔茨海默病（AD）神经元铁死亡的作用机制，为临床治疗提供参考。方法 选取雄性昆明种小鼠30只，随机分为空白组、模型组、模型+加药组，各10只。空白组小鼠腹腔注射等量的生理盐水和灌胃等量的双蒸水，模型组小鼠灌胃人β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）5 mg/kg（双蒸水配制）建立AD模型，模型+加药组小鼠在模型组基础上腹腔注射环磷酸腺苷（cAMP）筛选出的抑制LINC00472靶向药物。比较3组小鼠迷宫测试结果，脑组织炎症因子水平、β淀粉样蛋白（Aβ）mRNA水平、微管相关蛋白（tau）mRNA水平、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）mRNA水平、甲基转移酶3（METTL3）水平、凋亡信号调节激酶1（ASK1）水平及3组小鼠的Aβ、tau、GPX4免疫组化检测结果。结果 空白组、模型+加药组小鼠Y形迷宫觅食时间、莫里斯水迷宫（MWM）逃逸时间均短于模型组，且空白组均短于模型+加药组；空白组、模型+加药组小鼠MWM有效区域停留时间均长于模型组，且空白组长于模型+加药组（均P<0.05）。空白组、模型+加药组小鼠白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白（MCP-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Aβ mRNA、tau mRNA、METT3 mRNA、ASK1水平均低于模型组，且空白组均低于模型+加药组；空白组、模型+加药组小鼠GPX4 mRNA水平均高于模型组，且空白组高于模型+加药组（均P<0.05）。模型组小鼠海马体Aβ1-42沉积增加，模型+加药组Aβ1-42表达水平低于模型组；模型组小鼠海马体tau磷酸化增加，模型+加药组海马体tau磷酸化程度低于模型组；模型组小鼠海马体GPX4表达减少，模型+加药组海马体GPX4表达高于模型组。结论 LINC00472抑制有助于减轻神经炎症，减少Aβ沉积、tau磷酸化，并提高GPX4表达，进而通过抑制AD神经元铁死亡改善神经功能，且AD神经元铁死亡的作用机制与METT3/ASK1通路有关。

【关键词】长基因间非蛋白编码 RNA 472；阿尔茨海默病；铁死亡

【中图分类号】R322.8 【文献标识码】A 【文章编号】2096-2665.2024.21.0001.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.21.001

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是常见的神经退行性疾病，其发病原因和机制目前尚不明确，与遗传、环境、年龄增长等有关，可出现进行性加重性认知功能障碍与行为损害、记忆和学习能力受损，该病患者脑内的斑块、小胶质细胞、缠结神经元中可观察到铁沉积现象[1-2]。铁死亡是非凋亡性程序性细胞死亡，其特征为铁依赖性的脂质氢过氧化物累积到致死水平，是AD病理生理学的主要过程[3]。除铁死亡外，脑组织还易受到神经炎症的影响，铁滞留可触发AD中的小胶质细胞活化和白细胞介素产生，加剧淀粉样β蛋白（Aβ）沉积和微管相关蛋白（tau）磷酸化。有研究表明，铁死亡抑制剂在卒中疾病动物模型中具有保护神经元、恢复认知功能的作用[4]。长基因间非蛋白编码RNA 472（LINC00472）与铁死亡密切相关，其在多种肿瘤中的表达研究较多，但关于其在AD中的表达及作用机制相关研究较少。基于此，本研究探究LINC00472对AD神经元铁死亡的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取雄性昆明种小鼠30只[购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号： SCXK（沪）2020-0004]， 3月龄，体质量300～400 g。适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组、模型+加药组，各10只。

空白组小鼠腹腔注射等量的生理盐水和灌胃等量的双蒸水；模型组小鼠灌胃人β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）5 mg/kg（双蒸水配制）建立AD模型；模型+加药组小鼠在模型组基础上腹腔注射环磷酸腺苷（cAMP）筛选出的抑制LINC00472靶向药物，在造模成功1周后连续灌胃给药8周。 3组小鼠均于末次给药后进行迷宫实验，取脑组织，置于-80 ℃环境保存待测。研究过程遵循国际通行的动物福利和伦理准则。

1.2 研究方法 ⑴迷宫实验。 Y形迷宫由3个臂组成，包括1个起始臂和2个目标臂（每个臂的尺寸为30 cm×6 cm×30 cm）。训练小鼠3 d后进行测试。小鼠在正式测试前禁食12 h。第41天，在2个目标臂之一放置食物，将小鼠分别放置在起始臂末端，用摄像机记录每只小鼠的运动轨迹和寻找食物所用的时间，并使用

ANY-maze动物行为分析软件进行分析。

第43天使用莫里斯水迷宫（MWM）评估小鼠的空间记忆和导航能力，训练和正式测试均使用MT-200水迷宫视频跟踪分析系统进行。水槽被分成4个象限，向水槽中添加二氧化钛使水变浑浊。训练小鼠放入水中后有60 s内到达平台，并在平台上停留20 s。若有60 s内未找到平台，则手动带小鼠到平台上并停留20 s。共训练

3天。第46天和第47天分别在盲测条件下进行导航测试和探索试验，记录小鼠找到平台所用时间和（或）通过有效区域的时间。

⑵酶联免疫吸附试验（ELISA）。取小鼠脑组织，裂解、研磨，低速离心后取上清液，使用ELISA检测白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平。

⑶免疫组化染色。干燥载玻片，并用二甲苯和乙醇脱蜡。用柠檬酸缓冲液在100 ℃下进行载玻片表位检索，煮沸30 min，用3%过氧化氢孵育。切片用5%的牛血清白蛋白（BSA）阻断，然后用Aβ、tau、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）一抗（均购自和光纯药工业有限公司）孵育过夜。最后，加入山羊抗兔二抗孵育，并用3，3'-二氨基联苯胺（购自赛默飞世尔科技）染色。在反应结束时，用Harris苏木精进行反染色。用95%和100%乙醇和二甲苯洗涤脱水后，用永久贴载介质覆盖组织切片，在共聚焦显微镜下观察免疫组化染色情况。

⑷RNA分离和定量反转录PCR（qRT-PCR）。取大鼠脑组织在1 mL 组织裂解缓冲液中裂解，于冰浴状态下在玻璃研磨机中研磨成匀浆，然后4 ℃裂解30 min，离心20 min。成骨细胞使用1 mL 组织裂解缓冲液裂解后离心，使用TRIzol试剂提取总RNA，并使用Hifair Ⅲ第一链cDNA合成Super Mix转录成cDNA。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（购自赛默飞世尔科技）行定量实时PCR。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，根据2-ΔΔCt方法计算Aβ、tau、GPX4 mRNA表达水平。

⑸蛋白质印迹分析。取大鼠脑组织在1 mL组织裂解

缓冲液中裂解，于冰浴状态下在玻璃研磨机中研磨成匀浆，然后4 ℃裂解30 min，离心20 min。成骨细胞使用1 mL 组织裂解缓冲液裂解后离心，使用补充了1%苯基甲基磺酰氟的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液提取成骨细胞的蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF膜）上，用脱脂奶粉（5%）在含有0.05%Tween-20（TBST）的Tris缓冲盐溶液中封闭。然后，将PVDF膜分别与甲基转移酶

3（METTL3）、细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1）、β-肌动蛋白（β-actin）（购自和光纯药工业有限公司）在室温下过夜。用TBST洗涤后，将PVDF膜与二抗IgG，在室温下孵育2 h。将膜浸入增强型化学发光溶液。在无光条件下显影后，观察条带并拍照记录，以β-actin作为内参，使用2-ΔΔCt方法计算METT3、ASK1蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（x）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠迷宫实验结果比较 空白组、模型+加药组小鼠Y形迷宫觅食时间、 MWM逃逸时间均短于模型组，且空白组短于模型+加药组；空白组、模型+加药组小鼠MWM有效区域停留时间均长于模型组，且空白组长于模型+加药组，差异均有统计学意义（均P<0.05），

见表1。

2.2 3组小鼠脑组织炎症因子水平比较 空白组、模型+加药组小鼠IL-6、 MCP-1、 IL-1β水平均低于模型组，且空白组均低于模型+加药组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 3组小鼠脑组织Aβ、tau、GPX4免疫组化检测结果 模型组小鼠海马体Aβ1-42沉积增加，模型+加药组Aβ1-42低于模型组，见图1；模型组小鼠海马体tau磷酸化增加，模型+加药组海马体tau磷酸化低于模型组，见图2；模型组小鼠海马体GPX4表达减少，模型+加药组海马体GPX4表达高于模型组，见图3。

2.4 3组小鼠Aβ、 tau、 GPX4 mRNA相对表达水平比较 空白组、模型+加药组小鼠Aβ、 tau mRNA水平均低于模型组，且空白组均低于模型+加药组；空白组、模型+加药组小鼠GPX4 mRNA水平均高于模型组，且空白组高于模型+加药组，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表3。

2.5 3组小鼠METT3、 ASK1蛋白相对表达比较 空白组、模型+加药组小鼠METT3、 ASK1蛋白表达水平均低于模型组，且空白组均低于模型+加药组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。 3组小鼠METT3、 ASK1蛋白免疫印迹情况，见图4。

3 讨论

铁死亡是一种非凋亡性的细胞死亡形式，其在形态学、生化、遗传学上均不同于其他形式的细胞死亡（如凋亡、坏死、自噬），铁过载可在体内诱导铁死亡，而铁螯合剂可预防铁死亡[5]。铁死亡可见于各种神经系统疾病相关的神经元细胞死亡中，如出血性卒中、缺血性卒中、帕金森病、亨廷顿病等，并伴有脂质过氧化、线粒体功能障碍及GPX4减少[6]。

脑铁过载与AD等神经退行性疾病的病理机制相关，然而其潜在机制尚不明确。此外，铁死亡抑制剂已在卒中疾病动物模型中被证明可保护神经元、恢复认知功能，且敲除小鼠的 GPX4可直接导致年龄依赖性的神经退行性变化和严重的神经元丢失[7]。考虑AD 中过量铁的积累会导致脑内活性氧（ROS）的产生显著增加，因此，铁死亡可能与 AD 的神经元丢失和认知障碍有关。

Aβ、tau、GPX4是铁死亡及铁过载的重要反映指标。Aβ前体蛋白（APP）是一种1型跨膜糖蛋白，是Aβ生成的关键前体，可先被α-分泌酶或β-分泌酶切割，然后再被γ-分泌酶切割。在健康状态下，α-分泌酶首先切割APP，即处于非淀粉样变性途径。然而，APP首先被β-分泌酶切割，可产生具有神经毒性的40～42个氨基酸的淀粉样蛋白（淀粉样变性途径）。而弗林蛋白酶在介导α-分泌酶或

β-分泌酶的蛋白酶解活化率方面起关键作用，其浓度与

α-分泌酶活性呈正相关，与β-分泌酶活性呈负相关。胞内铁浓度过高可通过减少弗林蛋白酶，增强β分泌酶活性，从而增加淀粉样变性途径的Aβ生成。此外，APP mRNA是5'-非翻译区（5'-UTR）编码铁反应元件（IRE），该元件与胞内铁含量密切相关。当胞内铁浓度升高时，5'-UTR mRNA中的IRE上调APP的翻译，从而增加APP蛋白的数量，并促进Aβ的生成。铁还能直接与Aβ的His6、His13、His14氨基酸残基结合，从而增强Aβ的神经毒性[8]。

在APP/PS1小鼠AD模型中，亚微米分辨率的X线显微镜技术显示，淀粉样斑块形态与铁直接相关[9]。铁可通过诱导激酶影响蛋白磷酸酶 2A活性，促进tau过度磷酸化，还可通过tau蛋白中的铁结合基序引起过度磷酸化的 au聚集[10]。GPX4通过将膜脂质氢过氧化物还原为脂质醇来抑制脂质过氧化，被认为是铁死亡的中枢调节器。GPX4的敲除可诱导脊髓运动神经元的铁死亡，从而导致成年小鼠迅速瘫痪和死亡。有研究表明，铁死亡通过敲除前脑神经元GPX4，引发海马神经变性中的主要细胞死亡，这与认知障碍的发生发展直接相关。此外，铁沉积和肽-血红素复合物的形成与Aβ和tau相互作用，可产生涉及铁死亡途径的ROS[11]。

本研究结果显示，空白组、模型+加药组小鼠Y形迷宫觅食时间、MWM逃逸时间均短于模型组，且空白组短

于模型+加药组；空白组、模型+加药组小鼠MWM有效区域停留时间均长于模型组，且空白组长于模型+加药组，提示小鼠神经功能改善。且免疫组化及PCR实验证实，在AD小鼠中Aβ、tau表达增加，GPX4表达减少，LINC00472抑制则逆转其变化，表明LINC00472抑制有助于通过减少AD小鼠神经细胞铁死亡改善其神经功能。

ASK1是各种依赖于ros的细胞死亡过程中的关键调节因子，不仅参与氧化铝纳米颗粒诱导的海马神经元铁凋亡的调控，还能通过ASK1-p38 mapk通路，在冷应激诱导的铁凋亡中发挥重要作用[12]。有研究表明，ASK1参与多种ros依赖性细胞死亡过程，作为多个信号级联的枢纽[13]。本研究结果显示，空白组、模型+加药组METT3、ASK1蛋白表达低于模型组，空白组低于模型+加药组，推测LINC00472抑制可能是通过METT3/ASK1通路介导进而抑制AD小鼠神经细胞铁死亡。

综上所述，LINC00472抑制有助于抑制神经炎症，减少Aβ沉积、tau磷酸化，并提高GPX4表达，通过抑制铁死亡改善神经功能，且对阿尔茨海默病神经元铁死亡的作用机制与METT3/ASK1通路有关。

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1基金项目：2022年度黑龙江省省属本科高校基本科研业务费科学技术研究项目（编号：2022-KYYWF-0815）

作者简介：林萍，硕士研究生，副主任医师，研究方向：神经内科疾病的诊疗。