靶向核转录因子-κB的siRNA和甲氨蝶呤纳米脂质体对类风湿关节炎大鼠骨破坏的影响

【摘 要】目的：探讨靶向核转录因子-κB（NF-κB）的siRNA和甲氨蝶呤（MTX）复合纳米脂质体对胶原诱导类风湿关节炎模型大鼠骨破坏的影响。方法：将48只健康SD大鼠随机分为空白对照组

10只和造模组38只。造模成功的30只大鼠随机分为模型对照组、MTX组、MTX复合纳米脂质体组

（si-MTX组），每组10只。测量各组大鼠治疗前后体质量、脏器指数、足趾肿胀度、血清中炎性因子水平，以及滑膜组织中相关基因和蛋白的表达水平。结果：MTX和复合纳米脂质体均可显著降低胶原诱导性关节炎大鼠胸腺指数、脾指数、足跖肿胀度，降低血清中炎症因子水平，调节滑膜组织中相关基因和蛋白的表达（P < 0.05），且si-MTX组作用更强（P < 0.05）。结论：复合纳米脂质体发挥作用的机制可能是阻断了NF-κB通路，减少促炎因子释放，抑制骨吸收，保护关节软骨，且靶向性、安全性更高。

【关键词】 类风湿关节炎；siRNA；核转录因子-κB；甲氨蝶呤；纳米；脂质体；骨破坏

The Effects of siRNA Targeting Nuclear Transcription Factor-κB and Methotrexate Nanoliposomes on Bone Destruction in Rheumatoid Arthritis Rats

DUAN Wei-feng，ZHANG Jing-wei，LU Yan-yan，DU Zhi-jun

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of siRNA targeting nuclear transcription factor-κB and methotrexate nanoliposomes on bone destruction in rheumatoid arthritis rats.Methods：Forty-eight healthy SD rats were randomly divided into a blank control group of 10 rats and a model group of 38 rats.Thirty successfully modeled rats were randomly divided into a model control group，an MTX group，and an MTX composite nanoliposome group（si-MTX group），with 10 rats in each group，measuring the body mass，organ index，toe swelling，serum inflammatory factor levels，as well as the expression levels of related genes and proteins in synovial tissue of rats in each group before and after treatment.Results：Both MTX and composite nanoliposomes can significantly reduce thymus index，spleen index，and plantar swelling in collagen induced arthritis rats，lower serum levels of inflammatory factors，regulate the expression of related genes and proteins in synovial tissue

（P < 0.05），and the si-MTX group has a stronger effect（P < 0.05）.Conclusion：The mechanism by which composite nanoliposomes exert their effects may be by blocking the NF-κB pathway，reducing the release of pro-inflammatory factors，inhibiting bone resorption，and protecting articular cartilage;and it has higher targeting and safety.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;siRNA;nuclear transcription factor-κB;methotrexate;nanometre;liposomes;

bone destruction

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明确，病理特征表现为关节内炎性细胞浸润、滑膜细胞增生，以及软骨细胞破坏和骨质侵蚀［1］。目前，药物治疗的主要目标是缓解临床症状，降低疾病活动度，并最大限度地防止关节畸形和破坏［2］。欧洲抗风湿病联盟（EULAR）和美国风湿病学会（ACR）均建议将甲氨蝶呤（MTX）作为治疗RA的首选药物［3-4］。然而，长期大量使用MTX可能引发一系列不良反应，包括胃肠道、肝肾功能和心脏相关的不良反应［5-8］。

纳米载体能够将药物直接作用于关节炎症部位，这不仅降低了不良反应，还显著提高了疗效［9］。为了更深入地理解靶向治疗的细胞信号通路和分子靶点，笔者推测将siRNA与MTX联合使用，可能会产生协同作用，从而在减少MTX剂量的同时，降低不良反应的发生率［10］。鉴于核转录因子-κB（NF-κB）信号通路在滑膜增生、炎性细胞浸润，以及软骨细胞和骨质破坏过程中的关键作用，笔者设计了针对NF-κB家族成员p65的siRNA与MTX复合纳米脂质体。这一创新设计的目的是验证其在胶原诱导的RA模型大鼠中的治疗优势，以期为未来的临床应用提供有力支持。

1 实验材料

1.1 实验动物 48只健康雌性SPF级SD大鼠，6周龄，体质量（140±15）g，由斯贝福（北京）生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京）2024-0001。分笼饲养在河南中医药大学实验动物中心SPF级实验室。实验室环境保持恒温（23～25 ℃）和恒湿（60%～65%）。在实验开始前，所有大鼠进行1周的适应性饲养，期间自由饮食饮水。实验动物使用许可证号SYXK（豫）2021-0015。

1.2 实验药品和试剂 MTX（上海毕得医药科技有限公司，批号BD137723）；siRNA（上海吉玛基因股份有限公司，批号39755）；siRNA和MTX复合纳米脂质体（上海舜纳纳米科技有限公司，批号041523LPD）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号F5881）；免疫源性牛Ⅱ型胶原（美国Chondrex公司，批号CAT20022）；Trizol（美国Ambion公司，批号15596-026）；VEGFA抗体

（英国Abcam公司，批号ab155944）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒、白细胞介素（IL）-1β ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、NF-κB受体激活因子配体（RANKL）ELISA试剂盒、骨保护素（OPG）ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号分别为JYM0635Ra、JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0391Ra、JYM0510Ra）。

1.3 实验仪器 激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司，型号Mastersizer 3000）；透射电子显微镜（日本电子株式会社，型号JEOL2010）；高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，型号Aligent 1200）；垂直蛋白电泳槽及转膜仪（美国Bio-Rad公司，型号1658003）；凝胶成像系统（以色列DNR公司，型号Micro Chemi 4.2）；分析天平（波兰Radwag公司，型号AS220）；切片机（德国Leica 轮转式切片机，型号RM 2016）；显微镜（尼康Fi3型生物显微镜，型号DS Fi3）。

2 方 法

2.1 动物模型制作 48只健康SD大鼠随机筛选出10只作为空白对照组，剩余纳入造模组。采用Ⅱ型胶原诱导法构建模型，将0.3 mL质量分数为98.5%的冰醋酸加水得到摩尔浓度为

0.1 mol·L-1的溶液，将2 mg天然牛Ⅱ型胶原蛋白溶解于10 mL冰醋酸中，4 ℃保存备用。在注射当天，取出7 mL胶原溶解物与等体积的CFA混合，在冰水浴中充分乳化。随后在小鼠尾根部进行多点皮内注射。在第21天，再次进行注射以加强免疫。在剔除8只模型制作未成功的个体后，将模型制作成功的30只SD大鼠按完全随机分组法分为模型对照组、MTX组和复合纳米脂质体组（si-MTX组），每组10只。

2.2 siRNA和MTX复合纳米脂质体制备 取

2 mg甲氨蝶呤与20 mg DOTAP及适量胆固醇混合加入茄型瓶中，加2 mL三氯甲烷充分溶解，50 ℃旋蒸30～35 min。成膜后先用N2吹尽痕量三氯甲烷，加适量去离子水震摇水化（水浴超声15 min），后依次过400 nm、200 nm、80 nm

聚碳酸酯膜，制得载MTX阳离子脂质体溶液

（2 mL）。将20 μg的siRNA纯水溶液（质量分数50 μg·mL-1）与上述脂质体4 ℃混合，获得载RNA的MTX阳离子脂质体，4 ℃保存备用。

2.3 给药方法 自模型建立并验证成功之日起开始给药。按照人与动物间剂量换算标准，MTX组给予1 mg·kg-1 MTX尾静脉注射，si-MTX组则按照0.2 mg·kg-1纳米复合脂质体的剂量尾静脉注射；空白对照组和模型对照组给予2 mL生理盐水尾静脉注射，每周1次，连续给药3周。

2.4 观察指标

2.4.1 体质量及脏器指数观察 给药前和给药后第1，2，3周，对大鼠称重并详细记录。给药周期结束后处死动物，完整摘除大鼠的胸腺和脾脏，使用电子秤进行称重。

2.4.2 足跖肿胀度 给药前和给药后第1，2，3周，利用足跖容积仪对大鼠的足跖肿胀程度进行测定。

2.4.3 标本采集 模型制作成功当天，各组大鼠眼眶内取血2 mL。各组模型给药治疗后第21天，麻醉下腹主动脉取血约8 mL，室温下静置1 h，离心后取上层血清，置于-80 ℃冰箱内保存。无菌条件下取膝关节滑膜组织，一部分行HE染色，其余部分置-80 ℃冰箱内保存。

2.4.4 滑膜病理观察 取膝关节滑膜组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后脱蜡，苏木素、伊红染色，固定风干后封片，显微镜下观察各组大鼠滑膜组织病理变化情况。

2.4.5 ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL、OPG含量 于模型制作前、模型制作成功后，以及用药治疗后取大鼠血清，测定各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL、OPG含量。

2.4.6 PCR技术检测滑膜组织中NF-κB p65、IκB的mRNA表达水平 于模型制作前、模型制作成功后，以及用药治疗后，取大鼠膝关节滑膜组织，测定各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65、IκB的mRNA表达情况。

2.4.7 Western blot技术检测滑膜组织中NF-κB p65、IκB蛋白的表达水平 于模型制作前、模型制作成功后，以及用药治疗后，取大鼠膝关节滑膜组织，测定各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65、IκB蛋白的表达情况。

2.5 统计学方法 采用SPSS 27.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布或近似正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间重复资料采用重复测量方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠HE染色结果 空白对照组滑膜组织结构清晰，滑膜细胞排列规则，未见明显炎性细胞浸润；模型对照组滑膜细胞排列紊乱呈复层结构，间质内大量结缔组织增生，可见炎性细胞浸润；MTX组滑膜细胞排列紊乱，局部呈复层结构，可见少量炎性细胞浸润；si-MTX组滑膜细胞轻微增生呈复层结构，未见明显异常，未见明显炎性细胞浸润。见图1。

3.2 各组大鼠体质量比较 给药前，各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。给药1，2，3周后，各组大鼠体质量较治疗前均显著增加（P < 0.05）；与空白对照组比较，模型对照组、MTX组和si-MTX组均降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，MTX组和si-MTX组均有所上升

（P < 0.05）。MTX组与si-MTX组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

3.3 各组大鼠胸腺指数、脾指数比较 与空白对照组比较，其余各组大鼠的胸腺指数和脾指数均呈现显著上升趋势（P < 0.05）。与模型对照组比较，MTX组和si-MTX组均显著降低（P < 0.05）。MTX组与si-MTX组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

3.4 各组大鼠足跖肿胀度比较 与空白对照组比较，其余各组大鼠在给药1，2，3周后足跖肿胀度明显升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，MTX组和si-MTX组大鼠在给药2，3周后足跖肿胀度明显降低（P < 0.01）；MTX组与si-MTX组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3.5 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL、OPG含量比较 与空白对照组比较，其余各组大鼠血清TNa9033362f053d56006de3630c6f5ee4a195c4862d6cbc5075d59cb05fcd5dfefF-α、IL-1β、IL-6、RANKL含量明显升高（P < 0.05），OPG含量明显降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，MTX组和si-MTX组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL含量明显降低（P < 0.05），OPG含量明显升高（P < 0.05）；MTX组与si-MTX组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3.6 各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65、IκB mRNA表达水平比较 与空白对照组比较，其余各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65 mRNA表达水平明显升高，IκB mRNA表达水平明显降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，MTX组和si-MTX组大鼠滑膜组织中NF-κB p65 mRNA的表达水平明显降低，IκB mRNA表达水平明显升高（P < 0.05）；MTX组与si-MTX组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

3.7 各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65、IκB蛋白表达比较 与空白对照组比较，其余各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65蛋白表达水平明显升高，IκB蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，MTX组和si-MTX组大鼠滑膜组织中

NF-κB p65蛋白表达水平明显降低，IκB 蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）；MTX组与si-MTX组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3、图4。

4 讨 论

研究表明，免疫细胞的异常活化和炎症因子的过度释放对RA的发生、发展具有重要影响［11-13］。既往研究表明，作为一种调控炎症和免疫反应的关键途径，NF-κB信号通路在RA的病理过程中扮演着举足轻重的角色［14-15］。因此，调控NF-κB信号通路已成为治疗RA的重要策略之一。

破骨细胞在骨吸收过程中起核心作用，RANK及其配体RANKL在破骨细胞分化过程中起着关键的调控作用［16］。在正常生理状态下，RANKL通过与破骨细胞表面的RANK受体结合，诱导破骨细胞的成熟和骨吸收过程［17-19］。而OPG是一种可溶性的RANKL诱导受体，通过与RANKL结合，阻断RANKL与RANK的相互作用，从而抑制骨吸收过程［20-21］。因此，RANKL/RANK/OPG信号通路被视为RA患者全身关节破坏的潜在靶点［22］。

然而，该过程受到NF-κB信号通路的精确调控［23］，其中p50和p65亚单位形成的二聚体通常被视为NF-κB蛋白［24］。在生理状态下，其受到抑制性蛋白ⅠκB的约束，激活NF-κB的关键环节是IKK复合物对ⅠκB蛋白进行磷酸化和泛素化，从而使NF-κB二聚体得以释放并转移到细胞核内，进一步激活靶基因［25］。

siRNA在基因沉默和基因治疗领域的应用前景广阔，其独特的机制使得它成为众多疾病治疗的有力工具［26］。因此，针对NF-κB家族成员p65的siRNA成为治疗RA的潜在方案。但是，siRNA本身不能阻断炎症反应过程，笔者创新性地将siRNA与MTX结合，制备siRNA与MTX的复合纳米脂质体，通过纳米载药系统，将MTX精准传递于NF-κB通路的关键蛋白，实现协同治疗效果。实验结果表明，siRNA与复合MTX纳米脂质体能显著降低CIA模型大鼠滑膜组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子水平。证明siRNA与MTX的复合纳米脂质体能够有效抑制NF-κB信号通路的活化，阻止巨噬细胞释放炎性因子，进而改善关节滑膜的病理损伤。此外，还能提升OPG含量，降低RANKL含量，阻断RANKL与RANK的相互作用，抑制骨吸收，保护关节软骨，阻止关节破坏。

尽管siRNA与MTX复合纳米脂质体在治疗RA方面展现出巨大的潜力，但仍面临着一些挑战。复合纳米脂质体的制备工艺精细化是一个关键问题，其次药物释放动力学的深入研究也是至关重要的。相信随着不断优化制备工艺和药物释放系统，siRNA与MTX复合纳米脂质体将为RA患者带来更好的治疗效果。

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收稿日期：2024-05-04；修回日期：2024-06-18