右美托咪定通过激活Nrf2/HO-1/GPX4 通路抑制肾小管上皮细胞的铁死亡

摘要：目的 探讨右美托咪定（DEX）对Erastin诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）铁死亡的保护作用及其机制。方法 构建Erastin诱导的HK-2 细胞铁死亡模型。将HK-2 细胞分为对照组、Erastin 模型组、Erastin+2.5 μmol/L DEX组、Erastin+5 μmol/L DEX组、Erastin+10 μmol/L DEX组，采用CCK-8法检测细胞的存活率。将HK-2细胞分为对照组 、Erastin模型组、Erastin+10 μmol/LDEX组、Erastin+10 μmol/L DEX+ML385（Nrf2 抑制剂）组。采用CCK-8 法检测细胞的存活率；使用细胞亚铁比色法测试盒检测细胞内Fe2+水平的变化；应用流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）的含量；使用丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测细胞中MDA及GSH含量；Western blotting 检测细胞中核因子E2 相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）蛋白的表达。结果 与对照组相比，Erastin 组的细胞存活率显著被抑制（Plt;0.001），同时细胞中GSH含量降低（Plt;0.001），Fe2+、ROS以及MDA含量升高（Plt;0.001）；与Erastin组相比，Erastin+10 μmol/L DEX组的细胞存活率明显升高（Plt;0.001），10 μmol/L DEX显著升高细胞中GSH含量（Plt;0.001），显著降低Fe2+、ROS以及MDA含量（Plt;0.001），并且显著上调细胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达（Plt;0.001）。使用ML385后，Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制（Plt;0.001），细胞存活率降低（Plt;0.001），GSH含量降低（Plt;0.001），而Fe2+、ROS以及MDA含量升高（Plt;0.05）。结论 DEX对Erastin 诱导的HK-2 细胞铁死亡具有保护作用，其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。

关键词：右美托咪定；Erastin；人肾小管上皮细胞；铁死亡；Nrf2/HO-1/GPX4

肾小管上皮细胞铁死亡发生于急性肾损伤、肾缺血/再灌注损伤、糖尿病肾病和肾脏纤维化等多种肾脏疾病的病程中［1-4］，因此靶向调控铁死亡的策略将为防治上述肾脏疾病提供新的思路。铁死亡是一种新型的细胞程序性死亡方式，是由于依赖铁离子的脂质过氧化物的过量产生而发生的［5， 6］，其主要特征为细胞内铁离子聚积、活性氧（ROS）增多和谷胱甘肽（GSH）耗竭［7，8］。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞抗氧化的重要核转录因子，在氧化应激条件下易位到细胞核，激活下游的血红素加氧酶-1（HO-1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），通过影响脂质过氧化的生成进而调控铁死亡［9-11］。

右美托咪定（DEX）是一种临床麻醉辅助用药，具有镇静、抗焦虑和镇痛等作用。近年来研究发现，DEX可通过多种途径发挥肾脏保护作用［12-14］。研究证实，DEX可通过抑制氧化应激和细胞凋亡来减轻脂多糖（LPS）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）损伤［15］。然而，对于DEX确切的肾脏保护作用机制还不够清楚。DEX的肾脏保护作用与HK-2细胞铁死亡之间是否存在关联尚未有相关研究。因此，本研究将聚焦DEX对HK-2细胞铁死亡的作用及其调控机制，通过构建Erastin 诱导的HK-2细胞铁死亡模型，观察DEX对HK-2细胞铁死亡的保护作用，并以Nrf2/HO-1/GPX4抗氧化途径为切入点探讨其作用机制，为临床上肾脏疾病的治疗提供新的思路和靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.1.2 主要试剂

盐酸右美托咪定注射液（扬子江药业集团有限公司）；Erastin、ML385（MCE）；细胞亚铁比色法测试盒（Elabscience）；活性氧检测试剂盒（碧云天）；丙二醛检测试剂盒（赛维尔）；还原型谷胱甘肽测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2、HO-1、β-actin 抗体（碧云天）；GPX4抗体（Proteintech）。

1.1.3 主要仪器

高速冷冻离心机（艾本德）；二氧化碳培养箱（PHCbi）；酶标仪（Bio Tek）；流式细胞仪（BD）；化学发光凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HK-2 细胞培养在含10% FBS 的MEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，细胞达到80%融合时进行细胞传代，用于后续实验。

1.2.2 构建HK-2 细胞铁死亡模型

HK-2 细胞按6000/孔接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2 细胞培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后，向每孔加入铁死亡诱导剂Erastin 终浓度为2.5、5、7.5、10 μmol/L的培养基，每组设置3 个复孔。处理24 h 后，弃去旧培养基，每孔加入含10% CCK-8的培养基，37 ℃培养箱中孵育2 h后使用酶标仪检测各孔450 nm处吸光度，计算各组细胞存活率，以确定Erastin最佳的造模浓度。

1.2.3 实验分组

将HK-2细胞分为5组：对照组、Erastin模型组、Erastin+2.5 μmol/L DEX组、Erastin+5 μmol/LDEX组、Erastin+10 μmol/L DEX组，DEX预处理2 h，再加入5 μmol/L Erastin 诱导24 h 后进行后续实验；再将HK-2细胞分为4组：对照组、Erastin模型组、Erastin+10 μmol/L DEX 组、Erastin+10 μmol/L DEX+ML385组，用2 μmol/L ML385 预处理1 h，10 μmol/L DEX预处理2 h，再加入5 μmol/L Erastin诱导24 h后进行后续实验。

1.2.4 CCK8 法检测细胞存活率

HK-2 细胞接种于96孔板中，分组给药处理后，每孔加入含10% CCK-8的培养基，37 ℃培养箱中孵育2 h后使用酶标仪检测450 nm处吸光度，计算各组细胞存活率。

1.2.5 细胞内Fe2+的检测

HK-2 细胞接种于6 孔板中，分组给药处理后，消化并收集细胞，按照细胞亚铁比色法测试盒说明书中的操作于593 nm处检测吸光度，计算各组细胞内Fe2+的含量。

1.2.6 细胞内ROS的检测

HK-2细胞接种于6孔板中，分组给药处理后，加入DCFH-DA荧光探针，在37 ℃培养箱中孵育20 min后，弃旧培养液，消化并收集细胞，随后用300 μL PBS重悬，最后将重悬液通过流式细胞仪检测，并收集数据。

1.2.7 细胞内MDA、GSH的检测

细胞接种于6 孔板中，分组给药处理后，消化并收集细胞，按照MDA、GSH检测试剂盒说明书中的操作于532 nm、405 nm处检测吸光度，计算各组细胞内MDA、GSH的含量。

1.2.8 Western blotting 法检测蛋白表达

细胞接种于6孔板中，分组给药处理后，消化并收集细胞，使用裂解液提取细胞蛋白并定量，蛋白经高温变性后进行电泳、转膜、封闭、4 ℃孵育一抗过夜（Nrf2、HO-1、GPX4、β-actin抗体稀释比例均为1∶2000），洗膜后室温孵育二抗2 h，再次洗膜，随后进行化学发光显影，并采用ImageJ软件分析各组蛋白的灰度值。

1.3 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism8 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEX对Erastin处理后HK-2细胞存活率的影响

随着Erastin 浓度梯度升高，细胞存活率呈现梯度降低（Plt;0.001），当Erastin 浓度为5 μmol/L时，细胞存活率降至50%左右（图1A），因此选取Erastin最佳造模浓度为5 μmol/L。为探究DEX对Erastin诱导HK-2细胞铁死亡的抑制作用，不同浓度DEX（2.5、5、10 μmol/L）预处理2 h后加入5 μmol/L Erastin，数据表明，低、中、高浓度的DEX处理后HK-2细胞存活率相较于Erastin组均有不同程度的升高，且10 μmol/L DEX组的HK-2细胞存活率升高最为明显（Plt;0.001），所以选择10 μmol/L的DEX用于后续实验（图1B）。在10 μmol/L DEX的基础上使用Nrf2 抑制剂ML385，结果发现，ML385 使HK-2 细胞存活率较10 μmol/L DEX组降低（Plt;0.001，图1C），逆转了DEX对HK-2细胞的保护作用。

2.2 DEX对Erastin处理后HK-2细胞中Fe2+的影响

与对照组相较，Erastin 组细胞内Fe2+含量增加（Plt;0.001）；与Erastin组相较，10 μmol/L DEX使细胞内Fe2+含量明显降低（Plt;0.001）；在10 μmol/L DEX的基础上增加Nrf2 抑制剂ML385，数据表明，ML385 使细胞内Fe2+含量较10 μmol/L DEX组升高（Plt;0.05，图2）。

2.3 DEX对Erastin 处理后HK-2 细胞中Nrf2、HO-1 和GPX4蛋白表达的影响

与对照组相较，Erastin组HK-2细胞内Nrf2、HO-1和GPX4 蛋白的表达降低（Plt;0.01）；而与Erastin 组相比，10 μmol/L DEX处理组Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达显著升高（Plt;0.001）；而使用Nrf2 抑制剂ML385后，Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制，Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达降低（Plt;0.001，图3）。

2.4 DEX对Erastin处理后HK-2细胞中ROS的影响

采用流式细胞术检测细胞内ROS 含量，结果显示，与对照组相较，Erastin 组细胞内ROS 的含量升高（Plt;0.001）；DEX 可以减弱Erastin 损伤诱导的细胞内ROS 生成（Plt;0.001）；而在使用Nrf2 抑制剂ML385后，细胞内ROS 的含量升高（Plt;0.001，图4）。

2.5 DEX对Erastin 处理后HK-2 细胞中MDA和GSH的影响

与对照组相较，Erastin组细胞内MDA的含量升高（Plt;0.001，图5A），GSH的含量则降低（Plt;0.001，图5B）；与Erastin 组相比，DEX使细胞内MDA的含量明显降低（Plt;0.001，图5A），GSH的含量明显升高（Plt;0.001，图5B）；而在DEX 的基础上加用Nrf2 抑制剂ML385后，细胞内MDA的含量升高（Plt;0.05，图5A），GSH的含量则降低（Plt;0.001，图5B）。

3 讨论

近期研究表明，铁死亡与多种肾脏疾病的发生发展密切相关［16-18］，因此，早期干预铁死亡的发生，对肾脏病程的截断具有重要的意义。DEX可通过抗氧化应激、抗炎和抑制细胞凋亡等多种途径发挥肾脏保护作用［19， 20］。有文献报道，DEX对肾缺血再灌注损伤的保护作用与其抑制铁死亡有关［21］。目前关于DEX对肾脏疾病的保护作用的研究愈发深入，但DEX对Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡是否具有保护作用尚不清楚。为了探究DEX对HK-2 细胞铁死亡的保护作用，我们采用CCK-8法检测不同浓度的DEX对Erastin处理后HK-2细胞存活率的影响。实验结果表明，不同浓度的DEX均能增加Erastin处理后的HK-2细胞存活率，说明DEX能够减轻HK-2细胞铁死亡。加用ML385后，细胞存活率降低，这表明DEX抗HK-2细胞铁死亡的作用可能与其激活Nrf2有关。

当细胞发生铁死亡时，铁稳态的失衡会导致细胞内脂质过氧化的增加［22］。细胞内过量的铁通过芬顿反应产生大量ROS，致使细胞膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生大量脂质过氧化物。其次，铁参与脂氧合酶（LOX）的激活，LOX是含铁酶，可促进脂质过氧化物的产生［23， 24］。细胞内的脂质过氧化导致细胞和线粒体膜损伤和破裂，最终导致铁死亡［25］。另一方面，GSH是细胞内重要的抗氧化剂。GPX4是使用GSH作为还原底物的脂质过氧化的关键调节剂，GPX4可以将脂质过氧化物还原为脂质醇，从而减轻铁死亡［23， 24］。Erastin诱导HK-2 细胞发生铁死亡后，细胞内铁累积、GSH耗竭以及GPX4活性下降，细胞抗氧化能力降低，致使脂质过氧化与代谢功能障碍，ROS和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）大量累积。有文献指出，DEX对肾脏的保护作用与其抗氧化的能力有关［26］。本研究发现，DEX可以降低Erastin处理后HK-2细胞内Fe2+的含量，提高细胞内GSH的含量以及GPX4蛋白的表达，使用DEX增强了细胞的抗氧化能力，致使脂质过氧化物的分解增加，细胞内ROS和MDA的含量均下降。

Nrf2的激活在抑制铁死亡的过程中发挥着重要作用，Nrf2是细胞抗氧化反应的关键转录因子，转录调控与铁死亡相关的下游基因HO-1、GPX4 等的表达［27， 28］。有文献报道，通过激活Nrf2 抑制铁死亡不仅可以延缓糖尿病肾病的进展，还能够减轻叶酸或顺铂诱导的急性肾损伤［29-31］。本研究发现，DEX可以提高Erastin处理后HK-2细胞中Nrf2的表达，而Nrf2进一步激活铁死亡相关蛋白HO-1、GPX4 的表达，从而抑制Erastin 诱导的HK-2 细胞发生铁死亡。为了进一步探究Nrf2/HO-1/GPX4 通路是否参与了DEX对HK-2 细胞铁死亡的保护作用，我们加用了Nrf2抑制剂ML385。实验结果表明，Nrf2/HO-1/GPX4 通路的激活被抑制，细胞抗氧化能力降低，细胞内Fe2+和脂质过氧化产物的含量增加，表明Nrf2/HO-1/GPX4通路的抑制降低了DEX对HK-2细胞铁死亡的保护作用。

综上所述，DEX对Erastin 诱导的HK-2 细胞铁死亡具有抑制作用，其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制HK-2细胞发生铁死亡。本研究为DEX减轻HK-2细胞铁死亡的作用提供了一定的实验支撑，为临床上合理使用 DEX 提供了新的理论依据。后续研究将通过体内实验进一步验证DEX通过调控铁死亡治疗肾脏疾病的药效与机制。

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（编辑：经 媛）

基金项目：安徽省自然科学研究重点项目基金（KJ2021A0785）；蚌埠医学院研究生科研创新计划项目基金支持（Byycx22100）