2，6-二甲氧基-1，4-苯醌通过抑制NLRP3 炎症小体活化缓解小鼠的感染性休克

摘要：目的 探究发酵小麦胚芽提取物主要活性成分2，6-二甲氧基-1，4-苯醌（DMQ）抑制NLRP3炎症小体活化并缓解小鼠感染性休克的作用机制。方法 细胞学水平： 在BMDM细胞中，经脂多糖（LPS）预处理、DMQ 干预后，利用尼日利亚菌素（Nigericin）、ATP、尿酸钠结晶（MSU）分别活化经典NLRP3炎症小体以及胞内转染LPS活化非经典NLRP3炎症小体。利用聚脱氧腺苷酸（Poly A：T）活化AIM2炎症小体。在THP-1细胞中，利用Nigericin活化经典NLRP3炎症小体，通过Western blotting和ELISA方法测定NLRP3炎症小体活化产物的表达水平。蛋白分子水平：利用免疫共沉淀探究DMQ阻断NLRP3炎症小体活化的具体机制。动物水平：将8 周龄雄性C57BL/6J 小鼠随机分为空白对照组、感染性休克LPS 组、DMQ 20 mg/kg 治疗组、DMQ 40 mg/kg治疗组，6只/组，待DMQ治疗组小鼠预注射相应浓度DMQ后，对照组小鼠注射无菌PBS，其余3组小鼠腹腔注射相同剂量LPS，利用ELISA检测DMQ干预对LPS诱导的小鼠感染性休克模型中血清和腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β分泌水平的影响。DMQ预处理后注射LPS观察记录小鼠36 h内的生存状态并绘制生存曲线。结果 DMQ可有效抑制小鼠BMDM细胞和人THP-1细胞中经典NLRP3炎症小体活化（Plt;0.05），在小鼠BMDM细胞中对非经典NLRP3炎症小体活化也起到有效抑制作用（Plt;0.05），DMQ对AIM2炎症小体活化无影响（Pgt;0.05）。进一步实验结果揭示DMQ可阻断ASC和NLRP3之间的相互作用。DMQ治疗组可显著降低小鼠血清和腹腔液中IL-1β的分泌水平（Plt;0.05）并延长小鼠生存时间（Plt;0.05）。结论 发酵小麦胚芽提取物主要活性成分DMQ通过阻断ASC和NLRP3之间的相互作用有效抑制NLRP3炎症小体活化并缓解LPS诱导的小鼠感染性休克。

关键词：2，6-二甲氧基-1，4-苯醌；NLRP3 炎症小体；感染性休克；发酵小麦胚芽提取物

核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3（NLRP3）小体是由NOD样受体家族中NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1 前体组成的一类多聚蛋白复合物［1］。

NLRP3 炎症小体是先天免疫系统的一个重要组成部分，普遍存在于免疫细胞中，它在多种刺激下（如微生物感染和细胞损伤）通过激活caspase-1，促进炎性细胞因子IL-1β/IL-18的分泌，从而介导炎症反应，同时还可剪切GSDMD进而诱导细胞焦亡［2］。NLRP3 炎症小体的正常活化对维持机体稳态至关重要［3］。NLRP3炎症小体失调可导致大量炎性因子分泌，参与多种疾病的发生和发展，例如神经退行性疾病、代谢紊乱疾病、自身免疫炎性疾病与心血管疾病，其中包括癫痫［4］、酒精性肝炎［5］、慢性粒细胞白血病［6］和动脉粥样硬化［7］等。NLRP3炎症小体与多种炎性相关疾病的发生和发展有关。目前 NLRP3炎症小体相关疾病的临床治疗以IL-1β为靶点［8］，例如IL-1β抑制剂Canakinumab。但是靶向IL-1β的治疗手段存在具有非特异性和局限性的弊端，因此筛选出一种特异性好且作用显著的NLRP3炎症小体抑制剂尤为重要。

发酵小麦胚芽提取物，商品名为爱维麦（Avamer），是一种在2002年在匈牙利被注册为可应用于癌症患者的特殊营养品。有研究表明爱维麦具有独特的抗癌的作用［9］。爱维麦可导致肿瘤细胞中MHC Ⅰ类蛋白的下调，增加NK细胞识别、杀伤转移性肿瘤细胞的敏感性，可在化疗、手术、放疗后抑制转移性肿瘤的扩散和增殖［10］。除此之外，在人HT29 结肠癌细胞中，爱维麦可抑制细胞的核糖核苷酸还原酶活性，诱导细胞凋亡［11］。天然化学物质2，6-二甲氧基-1，4-苯醌（DMQ）是发酵小麦胚芽提取物中的主要生物活性成分［12］，存在于各种植物中，可以调节多种生物过程，例如电子传递活性［13］和氧化磷酸化［14］。DMQ通过调节AKT/mTOR信号通路和增强线粒体功能来增加骨骼肌质量和性能，可能有助于骨骼肌萎缩的治疗和预防［15］。据报道，DMQ具有良好的抗炎活性，能剂量依赖性地抑制LPS诱导的NO生成［16］。DMQ还具有显著的抗肿瘤活性，对TPA诱导的皮肤致癌作用有预防作用［16］、对4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）诱导的小鼠肺肿瘤有明显抑制作用［17］，还可以抑制胃癌细胞生长和诱导胃癌细胞凋亡。DMQ可以降低胃癌细胞中的mTOR信号通路Ki-67、磷酸化mTOR和磷酸化p70S6K的表达，是一种新型mTOR蛋白激酶抑制剂［18］。除此之外，DMQ在脂肪生成抑制中也发挥重要作用，可显著降低各种脂肪形成转录因子的表达，包括过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARs-γ），CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPα）以及脂肪细胞蛋白2（aP2）和脂肪酸合酶［19］。以上研究表明，DMQ对炎症、肿瘤以及脂肪生成均表现出良好的抑制效果，鉴于NLRP3炎症小体在恶性肿瘤、高脂诱发的2型糖尿病等疾病发生发展过程中发挥重要作用，但目前尚未有DMQ对NLRP3 炎症小体活化影响的报道。因此，本研究通过体内外实验探究发酵小麦胚芽提取物主要活性成分DMQ对NLRP3炎症小体活化的影响，以期为NLRP3炎症小体相关炎性疾病的治疗提供潜在的药物治疗方案。

1 材料和方法

1.1 实验动物和细胞株

6～8周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份技术有限公司，所有小鼠均饲养于无特定病原体（SPF）环境，温度22～24℃，光照时间为8：00～22：00，保持光照循环14 h光照10 h黑暗，定期观察小鼠生活状态，及时调整饲养条件，实验严格按照实验动物管理规范进行。急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。本研究所有动物实验均经蚌埠医科大学伦理委员会审核批准（伦动科批字［2020］第57号）。

1.2 试剂

2，6-Dimethoxy-1，4-benzoquinone（上海陶术生化，纯度99.46%）；高糖DMEM培养基；RPMI 1640 培养基；OPTI-MEM培养基；胎牛血清（Gibco）；红细胞裂解液、NP-40 裂解液（Beyotime）；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（Navoprotein）；尼日利亚菌素（Nigericin，MCE）；三磷酸腺苷（ATP）、尿酸钠结晶（MSU）（Sigma）；聚脱氧腺苷酸（Poly A：T）、脂多糖（LPS）、三酰酯肽（Pam3CK4）、佛波醇（PMA）、Lipofectamine2000（Invitrogen）；ELISA试剂盒（Mouse IL-1β、TNF-α、IL-6，Human IL-1β ELISA kit）（Ramp;D）；Anti-mouse caspase-1（p20）、Anti-NLRP3（AdipoGen）；Anti-mouse IL-1β（Ramp;D）、Anti- β-actin（Proteintech）；Anti-human p20、Anti-IgG、Anti-ASC（Cell Signaling Technology） ；Protein G Agarose（Merck）。

1.3 细胞提取与培养

小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的获取与培养：首先选取SPF级6～8周龄的雄性小鼠，经颈脱臼法处死后，浸泡酒精消毒，取腿骨存放于1.5 mL EP管，在经紫外灭菌超30 min 的超净工作台中剪去腿骨两端，用20 mL注射器吸取DMEM培养基反复冲洗获取腿骨中的细胞，离心后快速弃掉上清，根据细胞量加入2～3 mL红细胞裂解液，静置裂解2～3 min，于完全DMEM培养基中加入M-CSF 用于分化细胞，置于细胞培养箱并及时观察细胞生长状态。BMDM细胞呈细长梭形贴壁生长，通过流式细胞术鉴定巨噬细胞表面标志物（F4/80+CD11b+）。THP-1细胞的复苏与培养：从液氮中取出冻存的THP-1细胞，在37 ℃水浴锅快速化冻，皿中提前加入1640完全培养基，离心后弃上清，重悬之后分入各皿中，置于细胞培养箱培养并及时观察细胞生长状态。

1.4 细胞刺激

镜下观察细胞生长密度和分化状态，选取生长状态良好的BMDM/THP-1细胞，接种至12孔细胞培育板培养过夜。LPS（100 ng/mL）预处理4 h 后加入不同剂量DMQ，30 min 后加入多种经典NLRP3 炎症小体的激活剂，如Nigericin、ATP 和MSU。其中Nigericin 活化25 min、ATP活化35 min、MSU活化3.5 h。对于非经典NLRP3 炎症小体，我们首先用Pam3CK4（200 ng/mL）对BMDM细胞预处理3.5 h后，胞内转染LPS（2 μg/mL）活化非经典NLRP3 炎症小体。LPS（100 ng/mL）预处理4 h 后，Poly A：T（1 μg/mL）胞内转染4 h 活化AIM2炎症小体。

1.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）

将捕获抗体稀释后包被于固相载体上，室温孵育过夜，PBST洗板洗去未结合捕获抗体。加入封闭液孵育2 h，PBST洗板去除残余封闭液。加入待测样本（细胞上清液/血清/腹腔灌洗液）孵育1.5 h，PBST洗板去除未结合样本。加入检测抗体孵育1 h，PBST洗板去除未结合检测抗体。加入辣根过氧化物酶（HRP），避光孵育25 min，PBST洗板去除多余HRP。加入底物TMB后等待显色，10 min后加入10%H2SO4终止反应，5 min内于450 nm处读取吸光度，绘制标准曲线并计算各细胞因子分泌水平。

1.6 Western blotting检测

检测caspase-1（p20）和IL-1β蛋白分子的表达：首先收集细胞上清液，离心弃细胞沉淀，利用甲醇氯仿法提取蛋白，加入1.5×Sample Buffer，金属浴10 min。检测Pro-caspase-1（Pro-casp1）、Pro-IL-1β蛋白表达：向细胞培养板中加入1.5×Sample Buffer，裂解后收集至1.5 mL EP管中，100 ℃金属浴10 min。电泳步骤：首先根据蛋白分子量选择适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶，之后将蛋白转印到经甲醇激活的PVDF膜上，室温条件下用5 %BSA封闭1 h，使用PBST洗除残余BSA。随后，加入一抗抗体并于4 ℃条件孵育过夜，次日PBST洗去未结合一抗抗体。加入二抗抗体在室温条件下孵育1.5 h，PBST洗去未结合二抗抗体，及时使用凝胶成像系统对条带进行显影。

1.7 免疫共沉淀

选取生长状态良好的BMDM细胞接种至6 孔板中，用LPS进行预刺激，3 h后加DMQ于37 ℃温箱孵育30 min，加入Nigericin 活化NLRP3 炎症小体。待细胞活化后弃上清，加入NP-40裂解液充分裂解细胞，离心取上清，分为Input 组和IP 组。Input 组直接加入5×Sample Buffer，于100 ℃金属浴煮10 min。IP组加入相应抗体（Anti-IgG/Anti-NEK7/Anti-ASC），转盘4 ℃过夜。离心10 min弃上清加入Beads（Protein G），转盘于4 ℃条件孵育1 h，离心弃上清后加入5×Sample Buffer，金属浴10 min。

1.8 构建动物模型

1.8.1 构建小鼠感染性休克模型

挑选SPF级8周龄、体质量在20～21 g 的雄性C57BL/6J 小鼠随机分组（6 只/组）：空白对照组（Control组）、感染性休克组（LPS组）、DMQ 20 mg/kg 治疗组（LPS+DMQ 20 mg/kg）和DMQ40 mg/kg治疗组（LPS+DMQ 40 mg/kg）。DMQ治疗组小鼠腹腔注射DMQ（20 mg/kg、40 mg/kg） 50 min 后，Control组小鼠注射无菌PBS，另外3组小鼠腹腔注射等剂量的LPS（20 mg/kg），4 h后摘眼球取血、室温静置3 h离心获得眼球血上层血清。颈脱臼法处死小鼠，用1 mL注射器收集小鼠腹腔灌洗液。ELISA检测各组小鼠血清和腹腔灌洗液中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α分泌水平。

1.8.2 绘制生存曲线

用两种浓度（20 mg/kg、40 mg/kg）的DMQ预处理小鼠50 min 后，注射LPS 后观察各组小鼠36 h 内的死亡时间和存活率，使用GraphPadPrism 8.0软件绘制模型生存曲线。

1.9 统计学分析

数据分析和生存曲线的绘制均使用GraphPadPrism 8.0 软件完成。所有数据结果以均数±标准差表示，并采用独立样本t 检验来分析两组数据的差异，生存曲线采用Log-rank 法比较，Plt;0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMQ抑制Nigericin 诱导的经典NLRP3 炎症小体活化

在鼠BMDM细胞中，Western blotting检测结果显示，IL-1β和p20蛋白表达随DMQ增加呈剂量依赖性的降低趋势（Plt;0.05，图1A），但对Pro-IL-1β和Pro-casp1蛋白表达无影响（Pgt;0.05，图1A）。ELISA结果显示，IL-1β的分泌可随DMQ增加呈剂量依赖性的抑制趋势（Plt;0.05，图1B），但对NF-κB信号通路产生的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌无显著影响（Pgt;0.05，图1C、D）。在人THP-1 细胞中，Western blotting 结果显示，p20 蛋白表达随DMQ剂量增加呈降低趋势（Plt;0.05，图1E），但对Pro-casp1 的蛋白表达无显著影响（Pgt;0.05，图1E）。ELISA结果显示，IL-1β的分泌可被DMQ剂量依赖性地抑制（Plt;0.05，图1F）。

2.2 DMQ抑制ATP、MSU诱导的经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting 结果显示，IL-1β和p20 蛋白表达随DMQ剂量增加而降低（Plt;0.05，图2A），但对Pro-IL-1β和Pro-casp1蛋白的表达差异无统计学意义（Pgt;0.05，图2A）。ELISA 结果显示，在ATP、MSU 诱导经典NLRP3炎症小体活化后，IL-1β的分泌可随DMQ增加呈剂量依赖性的抑制趋势（Plt;0.05，图2B、C）在MSU诱导经典NLRP3 炎症小体活化后，Western blotting 结果显示，IL-1β和p20蛋白表达随DMQ增加呈剂量依赖性的降低趋势（Plt;0.05，图2D），但对Pro-IL-1β、Pro-casp-1蛋白的表达差异无统计学意义（Pgt;0.05，图2D）。

2.3 DMQ抑制胞内转染LPS诱导的非经典NLRP3 炎症小体

Western blotting 结果显示，IL-1β和p20 蛋白表达随DMQ增加呈剂量依赖性的抑制趋势（Plt;0.05，图3A），但对Pro-IL-1β和Pro-casp1 蛋白的表达差异无统计学意义（Pgt;0.05，图3A）。ELISA结果显示，IL-1β的分泌可随DMQ增加，呈剂量依赖性的抑制趋势（Plt;0.05，图3B）。

2.4 DMQ对Poly A：T诱导的AIM2炎症小体无影响

Western blotting 结果显示，与DMQ 抑制Nigericin 活化的NLRP3炎症小体相比，DMQ对AIM2炎症小体活化产生的各组分蛋白表达差异无统计学意义（Pgt;0.05，图4A～E）。ELISA结果显示，DMQ可显著抑制Nigericin 诱导的IL-1β分泌，但对Poly A：T 诱导的IL-1β分泌无抑制作用（Pgt;0.05，图4F）。

2.5 DMQ抑制NLRP3和ASC的相互作用

免疫共沉淀结果显示，NEK7、ASC与NLRP3存在相互作用，加入DMQ未能阻断NLRP3和NEK7之间的相互作用（Pgt;0.05，图5A～C），但可显著抑制下游NLRP3和ASC之间的相互作用（Plt;0.05图5D～F）。

2.6 DMQ可有效缓解LPS诱导的小鼠感染性休克

ELISA结果显示，与空白对照组相比，腹腔注射LPS 可导致感染性休克组小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-1β、TNF-α的分泌明显增加，DMQ治疗组中小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-1β的分泌水平随DMQ浓度增加呈而下降（Plt;0.05，图6A、C），但对TNF-α的分泌水平无影响（Pgt;0.05，图6B、D）。DMQ给药50 min后腹腔注射LPS，观察并及时记录小鼠36 h 内生存状态。结果显示，感染性休克组小鼠于第10 h开始死亡，29 h时小鼠全部死亡。DMQ 20 mg/kg 治疗组于25 h 开始有小鼠死亡（Plt;0.05，图6E），DMQ 40 mg/kg 治疗组于28 h 开始有小鼠死亡（Plt;0.05，图6E）。

3 讨论

NLRP3炎症小体在人类先天免疫系统扮演着不可或缺的角色，其正常活化对维持机体稳态至关重要，激活caspase-1并促进Pro-IL-1β和Pro-IL-18剪切为成熟的IL-1β和IL-18，以响应微生物感染和细胞损伤［20， 21］，但其异常失调可导致大量炎性因子释放并引发多种炎性相关疾病，如感染性休克［22］、冷吡啉相关周期性综合征［23］、类风湿关节炎［24］和缺血性中风［25］等，因此，靶向抑制NLRP3炎症小体活化可以成为干预相关炎性疾病的新思路［26］。

小麦胚芽含有多种矿物质和微量元素以及人体必需的营养物质，具有高营养、低毒性、易获取的优点。由于小麦胚芽易受氧化影响，为方便保存，日常食用的小麦在加工过程中基本去除了富含营养的胚芽，造成多种营养素流失。被去除的小麦胚芽多作为副产品或用于制作动物饲料，故深度开发和有效利用小麦胚芽资源尤为重要。近年来对于发酵小麦胚芽提取物的研究主要集中在其抗癌方面，对其抗炎功效研究不足。

当机体感受到病原微生物或其他危险信号的攻击时，NLRP3炎症小体被活化从而介导炎症反应，维持机体免疫稳态［27］。本研究利用Nigericin活化NLRP3炎症小体，通过检测Pro-casp1、Pro-IL-1β 和活化后的caspase-1（p20）以及IL-1β 分泌水平来观察DMQ 对NLRP3 炎症小体活化的影响，明确DMQ 可以抑制NLRP3炎症小体的活化，但不影响Pro-IL-1β、Pro-casp1蛋白表达水平，相比于其他mTOR抑制剂如红景天苷（Salidroside）对Nigericin 抑制浓度为50 μmol/L［28］，醌类化合物如大黄素（Emodin）对Nigericin抑制浓度约为50 μmol/L［29］，DMQ仅在10 μmol/L浓度就表现出更显著的抑制作用。此外， DMQ在经典NLRP3 炎症小体的激活剂ATP、MSU诱导的NLRP3炎症小体活化中也表现出良好的抑制效果，证明了DMQ抑制NLRP3炎症小体活化的非单一性。Caspase-11 可通过识别胞内LPS 激活非经典NLRP3 炎症小体［30］，实验结果表明，DMQ同样可以抑制非经典NLRP3炎症小体的活化。

AIM2 炎症小体和NLRP3 炎症小体一样，可以活化caspase-1，在抗病毒免疫反应中起重要作用［31］，为探究DMQ对NLRP3炎症小体的作用是否具有特异性，利用DMQ干预Poly A：T激活AIM2炎症小体，实验结果表明DMQ对AIM2炎症小体激活并无抑制作用，表明DMQ仅特异性抑制NLRP3炎症小体活化。

免疫共沉淀结果显示，DMQ可有效抑制NLRP3和ASC之间的结合，但对NEK7 和NLRP3 之间的结合无抑制作用，表明DMQ可直接影响NLRP3炎症小体组装活化。

在LPS 诱导的小鼠感染性休克模型中，LPS 使炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌显著增加，DMQ在20 mg/kg的浓度即可降低IL-1β的分泌水平，有效缓解小鼠感染性休克，延长小鼠生存时间。与天然产物二氢丹参酮Ⅰ缓解小鼠感染性休克的效果相比，DMQ在40 mg/kg药物浓度时效果更明显，小鼠存活率高于二氢丹参酮Ⅰ［32］。DMQ对于TNF-α的分泌水平无显著影响。以上结果表明DMQ可有效缓解NLRP3炎症小体介导的感染性休克，提示DMQ有作为治疗NLRP3炎症小体相关疾病候选药物的潜力。

综上所述，DMQ能够有效地抑制多种刺激剂在鼠BMDM细胞和人THP-1 细胞中诱导的NLRP3 炎症小体活化，阻断ASC和NLRP3 之间的相互作用，进而影响NLRP3炎症小体的组装和活化过程，缓解LPS诱导的小鼠感染性休克。本研究结果表明，DMQ对调节NLRP3 炎症小体活化中有着明显抑制作用，这为日后探索进一步DMQ抑制NLRP3炎症小体活化的作用机制提供了实验依据，有利于更好的深度开发和有效利用小麦胚芽的资源，同时为感染性休克及其他NLRP3炎症小体相关炎性疾病了治疗提供新的选择和思路。

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（编辑：余诗诗）

基金项目：国家自然科学基金（82071775）；安徽省自然科学基金（2108085QH349）；慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室开放课题基金（AHIAI2022K01）；安徽省科研编制计划优秀青年科研项目（2022AH030140）；蚌埠医学院2023 年度研究生科研创新计划项目（Byycx23070）；2022 年安徽省大学生创新创业训练计划项目（S202210367134）