苗药四大血减轻大鼠的类风湿性关节炎：基于下调基质金属蛋白表达

摘要：目的探究贵州苗医验方“四大血”（SX）对胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠关节骨、软骨破坏及滑膜血管新生的作用机制。方法将42 只SD大鼠均分为空白组（Nor）、模型组（Mod）、雷公藤多苷片阳性对照组（GTW，40 g/kg）和SX高、中、低剂量组（SX 40、20、10 g/kg），7只/组。通过皮下注射牛型II胶原来建立CIA大鼠模型，并且通过每天经口灌胃的方式给予治疗，持续3周。采用AI评分分别于造模前，灌胃前1周，灌胃后1周，灌胃2周，灌胃3周观察大鼠后足关节病变情况。HE染色法观察大鼠关节滑膜病理变化，ELISA法检测TNF-α、IL-1β，Real-time PCR检测滑膜组织中NF-κB p65、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达水平，Western blot检测滑膜组织中NF-κB p65、基质金属蛋白1（MMP1）、MMP2、MMP9蛋白表达水平。网络药理学获取SX外用途径治疗类风湿性关节炎（RA）中的重要靶蛋白，经拓扑分析后筛选出核心靶蛋白。结果GTW组和SX高、中、低剂量组足跖肿胀度及关节炎指数评分均小于Mod组（Plt;0.05）。光镜下观察大鼠关节滑膜病理组织切片，Mod组可见较多软骨细胞坏死，软骨下层骨组织受侵蚀，并有新生毛细血管形成；而GTW组和SX高、中、低剂量组中，软骨及骨损伤均有不同程度地降低，新生血管数量减少，随SX剂量增高，治疗效果呈逐渐增强的趋势。与Mod组相比，GTW组和SX高、中、低剂量组滑膜组织TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA和蛋白表达量有不同程度地降低（Plt;0.05）。经网络药理学分析得到外用SX治疗RA中的核心靶蛋白—MMPs。结论SX可以改善CIA大鼠关节骨和软骨的破坏、减缓滑膜血管新生，其机制可能为调节MMP基因表达的TNF-α/IL-1β/NF-κB-MMP1、2、9信号转导途径，下调MMPs表达水平，此外可初步推断MMPs在除口服治疗途径以外仍发挥关键作用。

关键词：苗医药方“四大血”；类风湿性关节炎；基质金属蛋白；网络药理学；关节骨和软骨的破坏

类风湿性关节炎（RA）是一种致残率较高的慢性自身免疫性疾病，滑膜组织侵犯和滑膜增生是RA发展的重要病理改变之一，可进而导致软骨和骨的破坏［1， 2］。目前其发病机制尚不完全清楚［3］。滑膜成纤维细胞（FLSs）在其发病机制中起主导作用［4］。前期课题组证明在RA中异常活化的RA-FLSs表现出类似于肿瘤样特性，可经历“肿瘤样”增殖、侵袭，并可迁移到未受影响的关节，附着在软骨和骨上，侵入细胞外基质（ECM）［5］。而ECM是维持骨组织完整性的重要结构成分。在正常的生理过程中，关节软骨基质蛋白的合成和降解处于动态平衡状态;然而，在RA患者中，这种平衡被破坏。关节软骨中的蛋白聚糖、胶原蛋白和ECM附属蛋白的损失，永久性地改变了组织的生物力学特性，最终导致滑膜关节衰竭［6］。在RA患者中，基质金属蛋白酶（MMPs）降解ECM被认为是关节破坏所必需的［7］。MMPs是生物体中一种重要的蛋白水解酶。在细胞因子的刺激下，滑膜细胞和血管内皮细胞产生多种基质金属蛋白酶，打破了细胞外基质的产生和降解之间的平衡，这是RA的重要发病机制之一［8］。而根据相关研究显示MMP-1、MMP-2、MMP-9能直接降解骨和软骨［7］，并能刺激内皮细胞， 使血管再生形成血管翳［8， 9］。