滇水金凤花蜜相关 SWEET7和 SWEET16的克隆及表达分析

摘 要 植物SWEET（Sugars will eventually be exported transporter）基因家族是一类重要的糖转运蛋白，参与开花植物的花蜜合成。本研究以野生型和突变型滇水金凤（Impatiens uliginosa）为材料，基于课题组前期的花距转录组数据，通过筛选和RT-PCR技术克隆得到花蜜相关基因 SWEET7和 SWEET16，分别命名为 IuSWEET7和 IuSWEET16，其cDNA分别为741 bp和903 bp，分别编码246和300个氨基酸。生物信息学分析表明：IuSWEET7为疏水性不稳定蛋白，IuSWEET16为疏水性稳定蛋白，二者均含有2个典型的MtN3/saliv保守结构域； IuSWEET7和 IuSWEET16基因的氨基酸序列与杜鹃花（KAG5539487.1）、一串红（XP_042052415.1）等植物同源序列的相似性均在54.15%～71.48%；系统进化分析表明， IuSWEET7和 IuSWEET16处于两个不同分支。qRT-PCR分析表明两个基因在野生型和突变型滇水金凤花距的3个时期中均有表达，且在不同部位中表达模式不同。其中 IuSWEET7基因在野生型滇水金凤中其表达量从花苞期至盛花期逐渐上升；在突变型2距和3距中其表达量从花苞期至盛花期先上升后下降，且在始花期表达量最高；而 IuSWEET16基因在野生型和突变型3距中其表达量从花苞期至盛花期均逐渐上升，但在突变型2距中其表达量从花苞期至盛花期先上升后下降，也在始花期时达到最高。

关键词 滇水金凤；花蜜； SWEET7基因； SWEET16基因；基因克隆；表达分析

植物的开花及传粉策略是植物有性繁殖成功与否的关键，花蜜在植物授粉系统中发挥着关键作用，植物通过调节花蜜的分泌与分布影响传粉者的访花行为，进而影响其种群的延续及发展。在植物授粉系统中，表征花蜜的常规指标有花蜜成分、花蜜量和花蜜浓度。花蜜成分及花蜜量与传粉者的访花频率、开花植物的授粉效率等存在很大的联系[1-4]。在自然界中，开花植物与其他物种之间存在着互惠、敌对等多种相互作用[5]，植物以花蜜作为访花报酬，吸引传粉者，体现了开花植物与传粉者间的互惠作用；有些花蜜对盗蜜者、部分传粉者具有驱避功能，体现了开花植物与传粉者、盗蜜者间的敌对作用，这可能与花蜜中所含的苦涩碱性化学成分有关[6]。此外，大量研究发现，蜜腺分泌花蜜，且花蜜质量与蜜腺结构存在一定的相关性[7-8]。

花蜜富含人体健康所需的多种营养成分[9]，成分主要为糖类化合物，以及少量的氨基酸、蛋白质、生物碱等物质，所以可将花蜜视为糖的水溶液[6]。糖类化合物不仅能够为植物自身代谢提供能量，其合成、转运及代谢对蛋白质、脂质合成有重要作用[10]。此外，糖类化合物对植物生长发育也发挥着重要作用，可作为信号分子调控植物生长发育，如种子萌发、花器官形成和逆境调控等过程[11]。大多数被子植物中的花蜜主要基于不同比例的蔗糖和单糖[12]，蔗糖是植物叶肉细胞光合作用的主要产物，也是最常见的糖类运输形式。SWEET蛋白作为一类新的糖转运蛋白[13]，不仅对蔗糖、葡萄糖及果糖等具有转运作用，而且可以对糖类的跨膜运输进行调控，从而参与植物的生长发育[14]。目前，对SWEET基因的深入研究主要在拟南芥和矮牵牛中。研究表明，拟南芥中的9个 AtSWEET9基因在花中集中表达[15]，其中 AtSWEET9在蜜腺中的表达量较高，且 AtSWEET9突变体表现出花蜜分泌减少[16]；矮牵牛的 NEC1基因与 AtSWEET9基因为同源基因，其在蜜腺中的表达量较高，且其表达量升高使花蜜的分泌量显著提升[17-18]。由此说明SWEET基因家族对花蜜分泌至关重要。

滇水金凤（Impatiens uliginosa）是凤仙花科（Balsaminaceae）凤仙花属（Impatiens）的一年或多年生植物，具有生长快、生物量大、周年开花、抗逆性强等特性，滇水金凤不仅花色多样，而且有奇特的花距结构，具有较高的观赏价值，也因此深受国内学者的广泛关注[19-20]。对于凤仙花的研究逐渐涉及各个方面，如杜晓华等[21]对凤仙花（Impatiens balsamina）和茶花凤仙（Impatiens balsamena）进行了多倍体诱导，张茜等[22]对四川西南地区的凤仙花属植物进行了花粉微形态研究。迄今为止，国内外尚未见有关凤仙花SWEET基因的报道。本研究通过分离克隆野生型和突变型滇水金凤SWEET基因，对其序列结构和系统进化进行分析；并通过qRT-PCR研究SWEET基因在滇水金凤野生型和突变型花距中不同时期及部位的时空表达模式，进而探究其在滇水金凤花距中花蜜生产的功能与作用，为滇水金凤野生型和突变型生态适应机制、花蜜形成的分子调控机制提供一定的基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滇水金凤1个花距的为野生型，2个和3个花距的为突变型。野生型和突变型材料均从昆明市捞鱼河湿地公园收集种子后，于2022年6月种植于西南林业大学树木园的温室大棚，待植株发育成熟，选取15棵健壮植株，采取发育完全的3个关键时期（花苞期、始花期、盛花期）的5个部位（1距、2距主距、2距侧距、3距主距、3距侧距）（图1）。试验材料从植株上分离后，用已灭菌的刀和镊子迅速分离距部，放入液氮中，存放于 -80 ℃冰箱中，备用。

1.2 总RNA的提取与SWEET7和SWEET16基因的克隆

利用RNA提取试剂盒（Omega美国）提取滇水金凤花距的总RNA；采用逆转录试剂盒EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物）将RNA逆转录成cDNA，-20 ℃保存，备用。以滇水金凤花距转录组中的 IuSWEET7和 IuSWEET16基因为依据，对引物进行设计（表1），并送往生物工程（上海）股份有限公司合成。以滇水金凤花距的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经回收纯化后，与载体pMD19-T连接，转化DH5感受态细胞，最后挑选阳性菌液生工测序。

1.3 SWEET7和SWEET16基因序列分析

运用Expasy在线软件（https：//web.expasy.org /protparam）对 SWEET7和 SWEET16基因的基本理化特性进行分析；利用SMART在线工具（http：//smart.embl-heidelberg.de）预测基因结构域；采用WoLF PSORT在线软件（https：//wolfpsort.hgc.jp）对IuSWEET7和IuSWEET16蛋白的亚细胞定位进行预测；借助SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测基因的三维空间结构；借助BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi）获得IuSWEET7和IuSWEET16蛋白的同源序列，利用DNAMAN 9.0软件对其进行比对分析；采取MEGA- X软件的邻接法（Bootstrap=1 000）进行系统进化分析；在string（http：//string-db.org/）网站选择8条IuSWEET蛋白制作互作网络。

1.4 SWEET7和SWEET16基因时空表达模式分析

分别提取野生型和突变型滇水金凤3个时期、5个部位的RNA，逆转录合成cDNA，-20 ℃冰箱保存，备用。设计 SWEET7和 SWEET16基因qRT-PCR引物，以IuActin作为内参基因，引物均购自于生工生物工程（上海）股份有限公司（表2）。借助Light Cycler 480 Ⅱ（Roche）实时定量PCR仪进行基因表达相对定量分析。每个样品进行3个重复，采用2-△△CT法计算。分别将2距盛花期侧距和3距花苞期侧距定义为单位1作为对照，对 SWEET7和 SWEET16基因在不同时期和不同部位的时空表达模式进行分析。

2 结果与分析

2.1 滇水金凤SWEET7和SWEET16基因的克隆[JP]

根据笔者课题组所测的野生型和突变型滇水金凤转录组数据来设计特异性引物，以滇水金凤花距的cDNA为模版进行 SWEET7和 SWEET16基因的cDNA扩增。经PCR扩增，获得 SWEET7和 SWEET16基因的全长cDNA序列，分别为741和903 bp（图2），分别编码246和300 aa。

2.2 滇水金凤SWEET7和SWEET16基因的序列结构分析

运用Expasy-ProtParam软件对野生型和突变型滇水金凤花距 SWEET7和 SWEET16基因的编码蛋白进行分析，结果表明，IuSWEET7和IuSWEET16的不稳定指数分别为41.59和 30.53（表3），IuSWEET7为不稳定蛋白，IuSWEET16为稳定蛋白。利用SMART分析结构域结果显示，二者均具备两个MtN3/saliva保守结构域（图3左）。利用TMHMM 2.0进行跨膜区预测，结果表明IuSWEET7和IuSWEET16蛋白分别存在7个和6个跨膜结构域。借助WOLF PSORT分析发现， IuSWEET7和 IuSWEET16基因亚细胞定位均于质膜上。此外，利用SOPMA二级结构分析软件对IuSWEET7和IuSWEET16蛋白进行预测，结果显示IuSWEET7蛋白的α-螺旋占比为41.87%，β-转角占比2.85%，延伸链为22.36%，无规则卷曲为32.93%；IuSWEET16蛋白的α-螺旋占比为52%，β-转角占比2.67%，延伸链为16%，无规则卷曲为 29.33%。运用SWISS-MODEL对IuSWEET7和IuSWEET16蛋白的三级结构进行预测，发现野生型和突变型滇水金凤花距的IuSWEET7和IuSWEET16蛋白高级结构均以 α-螺旋为主（图3右）。

2.3 滇水金凤SWEET7和SWEET16基因的系统进化分析

运用BLAST和DNAMAN软件将 SWEET7和 SWEET16[JP]编码的蛋白序列与其他物种进行同源性比对，发现二者与喜马拉雅凤仙花（I. glandulifera）的同源性最高，分别为 71.48%和 62.25%。利用MEGA软件构建系统进化树，发现IuSWEET7和IuSWEET16均与喜马拉雅凤仙花聚为一支，但处于两个不同分支（图4）。此外，IuSWEET7和IuSWEET16与杜鹃花（Rhododendron griersonianum）、羊踯躅（Rhododendron molle）、常绿越橘（Vaccinium darrowii）、山茶花（Camellia sinensis）、中华猕猴桃（Actinidia chinensis var.chinensis）、蓝果树（Nyssa sinensis）、潘那利番茄（Solanum pennellii）、番茄（Solanum lycopersicum）、粉红钟花（Handroanthus impetiginosus）、泡桐（Paulownia fortunei）、鼠尾草（Salvia hispanica）、一串红（Salvia splendens）等植物的SWEET7和SWEET16同源序列相似性均在54.15%～ 71.48%，并且如图5中红框所示，这些物种都包含有SWEET基因家族的两个典型MtN3/saliv结构域（图5）。

2.4 滇水金凤SWEET7和SWEET16基因的时空表达分析

研究发现， SWEET7和 SWEET16基因在滇水金凤发育的3个关键时期（花苞期、始花期和盛花期）及5个部位（1距、2距主距、2距侧距、3距主距和3距侧距）均有表达（图6）。 IuSWEET7基因在野生型1距中从花苞期至盛花期表达量逐渐上升；在突变型2距和3距中花苞期至盛花期表达量先上升后下降，在始花期时达到最高。 IuSWEET16基因在野生型1距和突变型3距中，从花苞期至盛花期表达量均逐渐上升；但在突变型2距中从花苞期至盛花期表达量先上升后下降，在始花期时达到最高。因此，SWEET7和 SWEET16基因在野生型和突变型花距中表现出不同的表达模式。从滇水金凤不同发育时期来看，除突变型2距的侧距外，花苞期和盛花期的 IuSWEET7和 IuSWEET16基因表达量在突变型中均显著高于野生型，与盛花期的突变型花蜜量显著高于野生型的结果一致。从滇水金凤不同部位来看，在野生型和突变型主距中， IuSWEET7和 IuSWEET16基因主要在盛花期时表达量较高；在侧距中， IuSWEET7和 IuSWEET16基因主要在花苞期时表达量较高。综上，推测侧距的花蜜量是从花苞期开始积累的，而主距中的花蜜量主要是盛花期产生的； IuSWEET7和 IuSWEET16基因在野生型和突变型花距的花蜜生产过程中均发挥了重要作用。

2.5 IuSWEET家族互作网络

探究蛋白之间的互作对研究基因功能有一定帮助。目前缺乏对IuSWEET蛋白互作的报道。通过同源比对，从野生型和突变型滇水金凤花距转录组中选择了与IuSWEET7和IuSWEET16同源性较高的IuSWEET1、IuSWEET2、IuSWEET4和IuSWEET17，制作了拟南芥中存在相互作用的SWEET互作网络（图7）。通过蛋白质互作网络发现，IuSWEET7和IuSWEET16蛋白之间相互作用，结合对野生型和突变型滇水金凤 SWEET7、 SWEET16基因的时空表达分析发现， IuSWEET7和 IuSWEET16在不同发育时期和不同部位中均有表达且表达模式不同。因此，可推测IuSWEET7和IuSWEET16蛋白相互作用共同来调控野生型和突变型花距中花蜜的 合成。

3 讨 论

花蜜是植物与授粉媒介相互作用的重要决定因素，也是授粉综合征的一个组成部分，花蜜是提供给传粉者的主要奖励，其数量、成分和位置是植物与传粉昆虫相互作用的重要决定因素[23]。糖类化合物是花蜜的主要组成部分，Fahn[24]学者研究维管植物中的分泌组织时预测，在蜜腺内发生转录过程中参与碳水化合物代谢的基因数量会明显增多，而一些酶和转运蛋白则能够改变花蜜中碳水化合物的组成，最终产生成熟的花蜜。在矮牵牛中利用传粉综合征确定了一个参与控制花蜜量和组成的单一QTL[25]，但至今参与这一现象的特定调控基因尚不清楚，参与蜜腺中花蜜合成和分泌相关基因表达方面的信息一直很缺乏。基于笔者课题组前期研究发现，野生型和突变型滇水金凤盛花期花距中的花蜜量存在较大差异，突变型2距和3距由于数目和花距形态等原因，单花的花蜜总量比野生型1距的多，这对提高吸引传粉者概率和频率是十分有利的。

SWEET基因家族只存在于植物中，参与花蜜合成分泌、韧皮部装载等一系列生理过程，被视为一类转运糖、糖醇和激素的载体。本研究从野生型和突变型滇水金凤中成功分离克隆出与花蜜合成转运相关基因 IuSWEET7和 IuSWEET16，跨膜结构域预测发现IuSWEET7具有SWEET家族典型的7个跨膜结构域，这与国外研究者们在拟南芥中发现的部分SWEETs也存在7个跨膜结构域的情况一致[26]；而IuSWEET16只有6个跨膜结构域。MtN3/saliv结构域是具有植物糖转运蛋白特异性的功能域，尤其是植物SWEET基因家族特有的功能域，与糖的跨膜运输有关[15]。本研究中两个基因编码的蛋白均有2个MtN3/saliv保守结构域，这与梁大曲等[27]发现在马尾松中包含典型的两个MtN3/saliv结构域的结果一致。同源性分析发现，野生型和突变型滇水金凤花距中 SWEET7和 SWEET16基因的氨基酸序列与杜鹃花、羊踯躅、山茶花等植物的SWEET基因同源性达71.48%和62.25%。

已有研究表明，植物SWEET基因家族有4个分支，分别为CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ和CladeⅣ。其中CladeⅠ（ SWEET1～ SWEET3）为己糖转运蛋白，主要转运葡萄糖；CladeⅡ（ SWEET4～ SWEET8）主要转运葡萄糖；CladeⅢ（ SWEET9～ SWEET15）主要转运蔗糖；CladeⅣ（ SWEET16～ SWEET17）是一种液泡膜转运蛋白，主要转运果糖[28]。通过分析滇水金凤野生型和突变型花距系统进化发现，IuSWEET7和IuSWEET16均与喜马拉雅凤仙花聚为一支，但IuSWEET7和IuSWEET16存在不同的分支，这与薛蓓蓓等[29]发现在木薯中 SWEET7和 SWEET16基因处于不同分支的结果一致，表明 IuSWEET7和 IuSWEET16在滇水金凤花蜜合成分泌中发挥着不同的作用。

SWEETs基因在不同植物及不同生长发育时期中表达特征具有较大差异，大部分与糖的合成转运密切相关，在泌蜜植物中发挥着重要作用。qRT-PCR分析发现， IuSWEET7和 IuSWEET16在滇水金凤野生型及突变型花距的花苞期、始花期、盛花期中均有表达。其中，野生型滇水金凤花距的 IuSWEET7和 IuSWEET16从花苞期至盛花期表达量上调，这与牡丹中SWEET基因时空表达一致[30]。通过对滇水金凤的IuSWEET7和IuSWEET16蛋白进行蛋白质互作预测发现其SWEET蛋白质之间可能存在相互作用，这与欧倩等[31]发现在慈竹SWEET蛋白间可能两两存在相互作用，共同调控糖的转运结果一致。所以，可推测IuSWEET7和IuSWEET16蛋白相互作用共同调控花蜜中糖的合成、转运和分泌。

滇水金凤的蜜腺结构和花蜜存在于花距中，基于盛花期花蜜量的差异，从野生型和突变型滇水金凤花距转录组中筛选出花蜜相关基因 IuSWEET7和 IuSWEET16。本研究发现的两个基因在滇水金凤野生型和突变型花蜜生产过程中发挥着重要作用，但其具体花蜜合成机制以及花蜜物质成分与传粉者之间的相互作用还有待深入研究。本研究不仅能够为探究滇水金凤花蜜的分子和生理机制提供一定的理论基础，而且能够为凤仙花物种繁殖、花形改良提供一定的基础数据和理论依据。

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Cloning and Expression Analysis of SWEET7 and SWEET16 Genes

Associated with Nectar in Spur of Impatiens uliginosa

ZHANG Xiaoli，TAN Yi，LI Fan，ZHAO Luqiu，SHI Wanlei，HUANG Haiquan and HUANG Meijuan

（College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences，Southwest Research Center for Engineering

Technology of Landscape Architecture （State Forestry and Grassland Administration），Yunnan Engineering

Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization，Research and Development Center

of Landscape Plants and Horticulture Flowers，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Abstract The SWEET （Sugars will eventually be exported transporter） gene family in plants is an important class of sugar transporter proteins involved in nectar synthesis in flowering plants. In this study，wild type and mutant Impatiens uliginosa were used as materials，the transcriptome data of the flower spur generated by our research group were used，we identified and cloned the nectar-related genes SWEET7 and SWEET16 through screening and RT-PCR techniques，designating them as IuSWEET7 and IuSWEET16，respectively. Their cDNA were 741 bp and 903 bp，encoding 246 and 300 amino acids，respectively. Bioinformatics analysis showed that IuSWEET7 was a hydrophobically unstable protein，while IuSWEET16 was a hydrophobically stable protein，both containing two typical MtN3/saliv conserved domains; the amino acid sequences of IuSWEET7 and IuSWEET16 genes showed similarity ranging from 54.15% to 71.48% to the homologous sequences in Rhododendron griersonianum and Salvia splendens; phylogenetic analysis showed that IuSWEET7 and IuSWEET16 belonged to two different branches. QRT-PCR analysis showed that both genes were expressed across three stages of flower spur in both wild-type and mutant I. uliginosa，with varying expression patterns in different organs. The expression of IuSWEET7 gene in wild-type I. uliginosa exhibited a gradual increase from the bud stage to the flowering stage. In the mutants，the expression first increased and then decreased in 2 and 3 spurs of mutants type，with the highest expression observed during the first flowering stage. The expression of IuSWEET16 gene increased gradually from the bud stage to the flowering stage in wild-type and 3 spur of mutant type. However，in the second spur of the mutant type，the expression increased at first and then decreased from the bud stage to the flowering stage，reaching its peak at the first flowering stage.

Key words Impatiens uliginosa; Nectar; SWEET7 gene; SWEET16 gene; Gene cloning; Expression analysis

Received 2023-08-25 Returned 2023-10-07

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No.32060364，No.32060366）;Major Science and Technology Special Project of Yunnan Province（No.202102AE090052）;Ph.D Supervisory Team of Genetic Improvement and Efficient Breeding of Garden Plants in Yunnan Province.

First author ZHANG Xiaoli，female，master student. Research area：landscape plants. E-mail：2536628677@qq.com

Corresponding author HUANG Meijuan，female，Ph.D，professor. Research area：landscape plants. E-mail：xmhhq2001@163.com

（责任编辑：潘学燕 Responsible editor：PAN Xueyan）

基金项目：国家自然科学基金（32060364，32060366）；云南省重大科技专项（202102AE090052）；云南省园林植物遗传改良与高效繁育博士生导师团队。

第一作者：张晓丽，女，硕士研究生，从事园林植物研究。E-mail：2536628677@qq.com

通信作者：黄美娟，女，博士，教授，从事园林植物研究。E-mail：xmhhq2001@163.com