棘孢木霉TspyrG基因选择标记转化体系的建立

摘 要 旨在从棘孢木霉Ts93中克隆获得尿嘧啶合成关键酶乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因（TspyrG），该基因无内含子，开放式阅读框大小为1 140 bp，编码1个379氨基酸的蛋白。通过农杆菌介导技术，获得棘孢木霉Ts93 TspyrG基因缺失突变株ΔTspyrG，突变株在不含尿嘧啶的培养基上无法生长。同时，以PCAMBIA1300质粒为骨架，构建转化载体1300pyrG。以ΔTspyrG突变株为受体菌，成功构建以尿嘧啶营养缺陷为选择标记的木霉菌农杆菌转化系统。对绿色荧光蛋白（eGFP）的转化试验表明，该系统转化效率与抗生素选择标记转化系统无明显差异。

关键词 棘孢木霉；营养缺陷型；农杆菌转化系统

木霉是土壤中广泛分布的一种丝状真菌，经过近一个世纪的研究，已经发现这类菌株在促进植物生长、抑制病原菌、诱导植物抗性等方面都具有明显效果，是一种应用广泛的生防菌[1-2]。同时，木霉菌具有生长迅速、基因组小、分生孢子为单倍体、分子遗传背景清晰等优点，有利于分子操作[3]。目前对木霉菌的分子操作主要选择抗生素作为筛选标记，如潮霉素、G418[4]等。抗生素选择标记由于成本高、环境污染大等缺点，不适于大规模突变株库的构建[5]。营养缺陷型筛选标记是较好的代替方案[6-8]，在酵母中已报道多种编码营养物质代谢相关酶的基因，特别是氨基酸合成（如L-组氨酸、L-亮氨酸、L-色氨酸等）相关酶[9]。其中乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶（EC：4.1.1.23）基因（pyrG）是常用的筛选标记。乳清苷-5′-磷酸脱羧酶是尿嘧啶核苷酸合成途径中一种关键酶，缺失该酶的突变株无法合成尿嘧啶，需要外源补充；同时，该酶可以将5-氟乳清酸（5-FOA）催化为5-氟乳清苷酸（5-FUMP），5-氟乳清苷酸具有很强的细胞毒性，导致含有pyrG基因的野生株不能在含有5-FOA的培养基中存活。因此5′-氟乳清酸（5-FOA）和尿嘧啶可以作为遗传转化的正向反向筛选标记[10]。

随着生物信息学技术在基因功能预测方面展示明显优势，功能基因的筛选已经有很强的预见性。但是，对于新功能基因的筛选，或者某些已知功能基因的新功能开发方面，突变株库构建及筛选仍具有明显优势。目前，丝状真菌中最常用的转化方法是农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation，ATMT）[11]。经过20多年的完善，ATMT已成功应用于50多种丝状真菌的转化[12]。而木霉菌的ATMT转化具有效率高、单拷贝插入概念高等优势。另外，突变株库的构建需要廉价、高效、安全的选择标记。本研究在前期以潮霉、G418作为筛选标记的木霉菌农杆菌转化系统的基础上，构建以TspyrG基因为筛选标记的农杆菌转化体系，以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）为受体，探讨无抗生素筛选标记的突变株库构建的可行性。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

棘孢木霉Ts93，南昌师范学院生科院真菌分子遗传实验室分离纯化，保藏在武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC NO：M2017147），该菌株已完成全基因组测序。质粒PCAMBIA1300、 eGFP、eYFP，南昌师范学院生科院真菌分子遗传实验室保存。

1.2 主要试剂与培养基

PCR相关酶、内切酶、T4连接酶等购自Takara公司。5-FOA和尿嘧啶购自Sigma公司。5-FOA用DMSO溶解，配制成600 mg/mL母液，备用；尿苷配制成6 mg/mL水溶液过滤除菌备用。

CA培养基：NaNO3 2 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖 30 g/L，琼脂粉 15 g/L，灭菌后按量加入尿苷至终浓度为60 mg/L。

PDA培养基：去皮土豆 200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉15 g/L。

1.3 试验方法

1.3.1 载体构建 以NCBI下载已知的pyrG基因序列，本地BLAST搜索Ts93全基因组序列，获取TspyrG基因序列。图1为载体图，载体构建主要过程如下：以pCAMBIA1300载体为骨架，用XhoⅠ单切后自连，去除潮霉素基因。然后扩增473 bp eYFP基因序列（只取了部分eYFP基因序列，用于后期敲除突变株的PCR验证，引物为XbeYFPU/BaeYFPL），通过XbaⅠ/BamHⅠ双切后连接成1300pyrGkh；敲除载体按照同源置换方法，设计引物（表1）分别扩增基因5′端1 079 bp同源序列（引物HiTspyrGSU/XbTspyrGSL），3′端974 bp同源序列（引物BaTspyrGXU/KpTspyrGXL），酶切连接至1300pyrGkh载体，构建TspyrG基因敲除载体1300ΔpyrG。设计引物扩增TspyrG基因ORF（引物XhTspyrGU/XhTspyrGL），以1300th载体为骨架，通过酶切连结，将其中的潮霉素抗性基因ORF替换为pyrG基因的ORF，构建TspyrG基因重组载体1300pyrG。转化效率检测选用绿色荧光eGFP基因（引物XbeGFPU / BaeGFPL），构建载体1300pyrGeG（图1）。eGFP基因重组过程如下：首先将eGFP与TspyrG两个基因分别加上启动子与终止子，然后在农杆菌介导转化过程中，由于左（left border）右（right border）边界内的序列都会随机整合进目标菌的基因组中，所以eGFP与pyrG这两个蛋白在各自的启动子下分别表达。所以，如果以TspyrG敲除突变株为受体菌进行转化，成功的转化子就会因为重新获得pyrG蛋白而恢复表型。而由于eGFP蛋白也成功转入，就会使转化子产生荧光现象。

1.3.2 ATMT转化 PDA培养获取木霉菌分生孢子，稀释至5×105 CFU/mL，与等体积已活化含对应载体的农杆菌混匀，取200 μL混合液涂板，具体操作方法参见Fu等[13]。

2 结果与分析

2.1 棘孢木霉Ts93pyrG基因克隆

于NCBI下载10个pyrG基因序列，通过本地BLAST，在 Ts93全基因组中搜索相似基因，筛选获得TspyrG基因，该基因无内含子，大小 1 140 bp，编码1个379氨基酸的蛋白（NCBI登录号OP186039），序列比对表明（图2），该蛋白与T.asperellum的乳清苷-5-磷酸脱羧酶（NCBI登录号GFP54067.1）相似度达到99.74%，蛋白质含有9个高度保守motif，与该酶的功能密切 相关。

2.2 5-FOA对Ts93菌株致死浓度确定

5-FOA按量添加至CA培养基，分别配制成终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的平板，接种直径0.5 cm的Ts93菌饼，测定对野生株的致死浓度。结果见图3，随着浓度的升高，菌落直径逐渐减小，至1.2 mg/mL时，Ts93完全无法生长，因此，为了降低突变株假阳性概率，将筛选浓度提高至1.5 mg/mL。

2.3 TspyrG基因敲除

通过ATMT方法进行基因敲除，其中TspyrG基因上游片段大小为1 080 bp，下游片段为946 bp，结果见图4-A，构建成功的载体见图4-B。共培养15个平板，挑选了33个可能的突变株。按照同源置换原理，TspyrG基因会被敲除载体中eYFP序列替换。因此，随机挑选6个突变株提取DNA，以eYFPU/eYFPL引物，扩增eYFP序列。结果见图4-C，其中1、3、5、6扩增条带明显。因此，挑选1号、3号两个突变株进行单孢分离纯化，挑取DNA，通过4轮PCR进一步确定是否为理想的TspyrG基因敲除突变株（图4-D）。PCR验证突变株的原理参考Fu等[13]。结果表明，TspyrG基因敲除突变株能够扩增到eYFP序列，同时，由于eYFP准确替换了TspyrG基因，所以在该基因5′同源序列上游的引物YZTspyrGu结合eYFPL引物可以扩增出条带。为了排除基因成功敲除的同时，会有额外的T-DNA随机整合在基因组其他位置，从而影响其他基因的功能，通过设计T-DNA的侧翼序列进行扩增，结果发现突变株未扩增出相应条带。结合PCR验证结果，确定TspyrG基因被成功敲除，同时无额外的T-DNA整合在基因组。

2.4 敲除突变株特性分析

随机挑选2个敲除突变株进行功能分析（图5）。在不含5-FOA与尿苷的CA培养基上，Ts93生长正常，而两突变株无法生长；添加尿苷后，Ts93与两株突变株均能正常生长；而在添加了

5-FOA、不加尿苷的培养基上，3个菌株均无法生长；同时添加5-FOA与尿苷情况下，Ts93无法生长，而2个突变株生长正常。结果表明，敲除TspyrG基因后，菌株无法自主合成尿嘧啶，需要额外补充，但突变株同时具有抗5-FOA的能力（图5）。

为了进一步确定该基因破坏后是否会影响菌株其他生理功能，分析突变株的生长与产孢能力（图6）。在PDA培养基上，培养24 h后，Ts93与突变株菌落直径均达到7.0 cm左右，三者生长速度无明显差异（P>0.05）；培养96 h后，菌株都产绿色孢子，孢子量均达到107CFU/mL，三者产孢量也无明显差异（P>0.05）。综合研究结果表明，TspyrG基因对菌株生长等功能无明显影响。

2.5 尿苷营养缺陷型突变株库的构建

为验证该基因作为选择标记的可靠性，以ΔTspyrG突变株作为受体菌，以改造后的1300pyrGeG为转化载体，通过农杆菌介导技术进行转化。由于载体中含有TspyrG基因的完整表达框，成功转化的菌株可以在不含尿苷的基础

培养基上正常生长，以此作为筛选标记挑选出成功的转化子。同时，用eGFP（enhanced green fluorescent protein，增强型绿色荧光蛋白）基因进一步检测转化效果。结果表明，共培养15个平板，筛选获得30个可能的突变株，与基因敲除中30个板共获得33个突变株无明显差异。同时，30个突变株的生长速度有明显差异，其中5个比野生菌Ts93快，7个比野生株慢，其他菌株无明显差异（图1）。随机挑选2个转化成功的突变株（生长速度与野生株无明显差异）进行分析，其中突变株1在28 ℃培养12 h，突变株2培养 26 h。结果表明（图7），在不含5-FOA与尿苷的CA培养基上，Ts93与回补株均能正常生长，但ΔTspyrG由于无法合成尿嘧啶而不能生长；在补充尿苷后，三者都能够正常生长；而在只加5-FOA但不含尿苷的CA培养基上，三者均不能生长；当5-FOA与尿苷都补充后，ΔTspyrG可以生长，其他两株均无法生长。eGFP基因成功转化，菌丝与分生孢子梗有明显荧光。同时，通过PCR对突变株进行验证。选取引物XhTspyrgU/XhTspyrGL扩增TspyrG基因ORF（1 156 bp），其中野生株（泳道1）与回补突变株（泳道2）均可以扩增到该基因片段，但是敲除突变株无法扩增到基因片段。综合上述结果表明，以ΔTspyrG为受体菌进行转化后，由于TspyrG基因的回补，使ΔTspyrG回复了野生株特性。

3 讨论与结论

在本研究中，建立了一种无抗生素筛选标记的木霉菌转化系统，该系统能够用于随机突变株库的构建，同时，TspyrG基因也可以作为转基因过程的一种筛选标记，用于基因操作。该基因在酵母菌中研究很详细，是常用的一种营养缺陷型选择标记[14-15]，在丝状真菌中对该基因的研究主要集中在曲霉及部分植物病原菌[16-17]。木霉菌中关于该基因的研究最早是Berges等[18]在里氏木霉中（T.reesei）的突变株库中发现两个相关基因ura3和ura5。而本研究首次在棘孢木霉中克隆出该基因，同时，也分析了该基因作为筛选标记的可行性。基因分析表明，丝状真菌中该基因的同源性很高，具有9个保守的Motif，蛋白质大小在300～500氨基酸。进一步研究表明，该基因破坏后，对于菌株的生长、产孢等能力无明显影响，这也为今后用于构建随机突变株并筛选功能基因提供保障。同时，以ΔTspyrG为受体菌构建突变株，只需要使用基础培养基即可筛选获得随机突变株，大大节约了筛选成本，降低了抗生素的环境污染。对eGFP基因的转化试验表明，成功转化后的突变株在性状上回复了野生株的特性，而且该转化系统获得的突变株具备T-DNA的随机整合特性，产生的突变株大部分生长无明显影响，但也有部分菌株出现生长缓慢、产孢能力减弱现象，说明T-DNA的随机整合造成了部分功能基因的缺失，从而影响菌株生长。木霉菌是传统的生防菌，具备诱导植物抗性、拮抗病原菌、降解环境污染物等多种功能，而且具备基因组小，分生孢子单倍体等适合遗传转化特性，是很好的基因功能研究材料。而TspyrG基因作为一种遗传选择标记，可用于基因分子操作如双敲除、多基因敲除，具备实际应用价值。

本研究从棘孢木霉Ts93中克隆获得编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因TspyrG，该基因缺失后，菌株无法在基础培养基上生长，需要额外补充尿嘧啶，但突变株能够耐受1.0 mg/mL的5-FOA。以该基因缺失突变株为受体菌，通过回补试验表明，回补突变株能够恢复缺失功能，同时，转化具备随机整合特性，说明，该基因可以作为 Ts93基因操作的筛选标记。

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Establishment of Transformant System for Trichoderma asperellum Using TspyrG as Selected Marker

FAN Lili，WEI Runling，FU Kehe，LIU Wentao and SHI Jing

（Department of Biology，Nanchang Normal University，Nanchang 330032，China）

Abstract In this study，weTcqgh3FJQioCvUKLSL+GYg== cloned a TspyrG gene，which encodes orotidine-5′-phosphate decarboxylase，an essential enzyme in pyrimidine biosynthesis in T.asperellum Ts93 strain.The TspyrG gene，which does not contain introns，comprises an open reading frame of 1 140 codons and encode a 379 aa protein.The ΔtspyrG mutants were obtained via Agrobacterium-mediated transformation，which were unable to grow without the uracil.And the transformant plasmid 1300pyrG was constructed successfully based on the plasmid PCAMBIA1300.Agrobacterium transformation system with uracil auxotroph maker was successfully constructed using ΔTspyrG as recipient strain.Transformant of eGFP showed no significant difference between auxotrophic selection marker and antibiotic selection marker in the transformant system.

Key words Trichoderma asperellum; Auxotroph; Agrobacterium-mediated transformation

Received 2023-03-06 Returned 2023-04-06

Foundation item Project of Jiangxi Provincial Department of Education （No.151252，No.GJJ161233）;Regional Project of National Natural Science Foundation of China（No.31660020）.

First author FAN Lili，female，Ph.D，lecturer.Research area：molecular genetics of Trichoderma. E-mail：llfan31@163.com

Corresponding author FU Kehe，male，Ph.D，lecturer.Research area：microbial soil remediation. E-mail：khfu0112@163.com

（责任编辑：郭柏寿 Responsible editor：GUO Baishou）

基金项目：江西省教育厅项目（151252，GJJ161233）；国家自然科学基金地区项目（31660020）。

第一作者：范莉莉，女，博士，讲师，主要从事木霉菌分子遗传研究。E-mail：llfan31@163.com

通信作者：傅科鹤，男，博士，讲师，主要从事微生物土壤修复研究。E-mail：khfu0112@163.com