基于流式细胞术的蜘蛛抱蛋属植物倍性检测和核DNA含量测定体系的建立

摘 要 为建立适用于蜘蛛抱蛋属植物的倍性检测及其核DNA含量的流式细胞术方法，以蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片为材料，比较了WPB解离液、LB01解离液、Galbraith’s解离液以及改良Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液的效果。结果表明：改良Galbraith’s解离液能够更广泛地适用于蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片的细胞核悬液的制备且效果较好。利用改良Galbraith’s解离液对12种13个居群的蜘蛛抱蛋属植物进行倍性检测，并通过染色体制片计数法进行验证。结果表明：12种蜘蛛抱蛋属植物的DNA含量的荧光强度峰值范围为1 753 078.81～5 817 826.99。其中，11种二倍体植物的峰值范围为1 753 078.81～2 937 690.80，四倍体辐花蜘蛛抱蛋的峰值为3 892 503.69，六倍体泰国蜘蛛抱蛋的峰值为5 817 826.99。此外，以葱为内标，对以上蜘蛛抱蛋属植物的核DNA含量进行测定和估算，首次估测了11种蜘蛛抱蛋植物的核DNA含量，蜘蛛抱蛋的DNA含量与已有报道的结果相近。其中，二倍体植物的核DNA含量为14.16～18.73 Gb；四倍体辐花蜘蛛抱蛋的核DNA含量为28.33 Gb；六倍体泰国蜘蛛抱蛋的核DNA含量为43.03 Gb。结果可为蜘蛛抱蛋属植物的遗传育种研究、全基因组研究以及喀斯特植物的起源与演化研究提供重要科学依据。

关键词 蜘蛛抱蛋属；染色体数目；流式细胞术；倍性水平；核DNA含量

DNA是生物体内遗传信息的携带者，控制着生物体的生存和繁衍[1]。生物体内的DNA含量通常是恒定的，借助流式细胞术可成功测定植物的核DNA含量，为基因组学和进化生物学等领域的研究提供理论基础[2-3]。Galbraith等[4]首次应用流式细胞仪成功检测了17种植物的DNA含量，开创了流式细胞术应用于植物学研究的先河。此后，由于流式细胞术具有操作简便、高效且结果准确等优点，被广泛应用于植物核DNA含量的测定和倍性鉴定[5-8]。

倍性鉴定不仅是评价植物nNlZLWTC/C+0A1bfm0hh+3Q09rkrzBZGGXJucaL4OXw=资源的主要内容，还对植物资源的开发利用具有重要的意义。植物倍性水平检测的主要方法有染色体制片计数法和流式细胞术法[9]。传统的植物倍性检测主要依靠染色体制片计数法，该方法操作技术难度大且耗时长，不宜大规模对植株开展倍性鉴定；而流式细胞术法具有操作简单、快速、结果可靠等优点，在很大程度上克服了传统染色体制片计数法的缺点，常用于植物种质资源和遗传研究中植株倍性的快速批量检测，如苹果、枣、葡萄、百合、杏、吊钟花属、石斛以及凉粉草等[10-17]。

流式细胞术能够成功检测植株倍性的关键在于获得高质量的细胞核悬浮液[18]。目前，已报道多种提取细胞核的解离液，如沈捷等[19]选择Lysis buffer LB01作为制备杉木根尖细胞核悬液的最佳分离缓冲液。吴丽萍等[20]发现WPB解离液适合制备枣属植物细胞核悬液。邹璇等[21]比较了WPB解离液、Tris·MgCl2解离液、Galbraith’s解离液以及LB01解离液对玉兰亚属植物叶片细胞核悬液的裂解效果，结果发现WPB解离液最适合木兰科玉兰亚属植物。刘凤霞等[22]发现Galbraith’s解离液为提取梨叶片细胞核的适宜缓冲液。由于不同类群的植物体内所含的化学成分复杂多样，在采用流式细胞术建立特定类群植物的倍性鉴定和DNA含量的测定体系时，需要比较不同解离液的裂解效果，筛选出适合的解离液，甚至可能需要对筛选出来的解离液的成分进行适当改良，以获得最佳的细胞核分离效果。[JP]

蜘蛛抱蛋属（Aspidistra）为多年生草本植物，隶属于天门冬科（Asparagaceae），原产于亚洲东部的热带和亚热带地区，在全世界范围内已知该属植物200余种，其中尤以中国西南部和越南北部地区产的种类最为丰富[23-24]。蜘蛛抱蛋属植物种类众多，具有一定的观赏价值，其叶子四季常青，且叶片上带些许黄色或白色的斑点或条纹，是插花艺术上常用的高级叶材[25]。该属植物的根状茎在民间可作药用，具有一定的药用价值[26]。目前，通过传统的染色体制片计数法已报道了65种[27]蜘蛛抱蛋属植物的染色体倍性，分别有二倍体（2n = 36或2n = 38）、四倍体（2n=76）以及六倍体（2n=114）。通过流式细胞术测定蜘蛛抱蛋属植物的核DNA含量的研究资料较少，仅Bharathan等[28]利用流式细胞术报道过蜘蛛抱蛋（A.elatior）的C值为17.90 pg。本研究以蜘蛛抱蛋属植物的成熟叶片为材料，筛选出适合蜘蛛抱蛋属植物的细胞核解离液，拟建立一套蜘蛛抱蛋属植物的倍性检测和核DNA含量的测定体系，为蜘蛛抱蛋属的基因组学研究、系统发育和进化研究提供科学依据，同时也为该属植物种质资源的开发和利用以及遗传育种提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野外采集产自中国4个省（自治区）9个县以及泰国清迈的蜘蛛抱蛋属植物的活体植株（表1）。移栽于广西民族大学温室大棚中，其成熟叶片用于流式细胞术检测，幼嫩的根尖用于染色体制片实验。

1.2 试验方法

1.2.1 植物细胞核解离液的配制 共选用4种细胞核解离液，分别为WPB解离液[29]、LB01解离液[30]，Galbraith’s解离液[31]以及改良的Galbraith’s解离液，成分及配制方法见表2。其中，改良Galbraith’s解离液是在Galbraith’s解离液原有成分的基础上，增加了聚乙烯吡咯烷酮（PVP），二硫苏糖醇（DTT），抗坏血酸，乙二胺四乙酸（EDTA）以及β-巯基还原剂。

1.2.2 流式细胞术检测法 （1）细胞核悬液的制备：称取0.5～1 g叶片，加入1～2 mL预冷的细胞核解离液，冰上快速垂直切割样品。经40 μm的滤膜过滤，4 ℃ 孵育5 min，后离心5 min （1 000 r/min）弃上清，加入500 μL 预冷的细胞核解离液、20 μL 1 mg/mL RNase溶液和20 μL 1 mg/mL PI（碘化丙啶）荧光染液，混匀得到细胞核悬液，避光染色0.5～1 h。

（2）流式细胞仪检测和分析：使用美国Becton Dickinson公司的BD Accuri C6 Plus流式细胞仪，采用FL2通道，每张叶片进行3次生物学重复，每个样品检测至少10 000个细胞，取平均值。

使用流式细胞仪自带的软件BD Accuri C6 Plus 对流式细胞术试验的数据进行采集和分析，得到各样品的峰值直方图。以CV值（DNA峰的变异系数）的大小评价流式测定结果数据质量的优劣，样品平均峰值的变异系数CV%（coefficientof variation）大于8%的结果予以舍弃[32]。

（3）倍性鉴定和DNA含量测定：采用二倍体辐花蜘蛛抱蛋（Aspidistra subrotata）为倍性检测的外部参照[33]，推测蜘蛛抱蛋属其他物种的倍性水平，计算公式为：DNA含量比值=待测样品DNA含量荧光强度峰值均值/对照样品DNA含量荧光强度峰值均值。

以已完成全基因组测序的葱（Allium fistulosum）[34]作为测定蜘蛛抱蛋属植物细胞核DNA含量的内部参照，即标准样品的核DNA含量为 11.27 Gb。计算公式为：细胞核DNA含量 （Gb）=待测样品的DNA含量荧光强度峰值均值/标准样品的DNA含量荧光强度峰值均值×标准样品的核DNA含量。

1.2.3 染色体制片计数法 取生长活跃的根尖置于0.1%的秋水仙素溶液中室温处理2.5～3 h后水洗2～3次，转移至卡诺固定液（冰乙酸∶无水乙醇为1∶3）中处理30 min。取已固定的根尖水洗2～3次后，置于1 mol/L盐酸与45%醋酸混合液（比例为1∶1）中，60 ℃水浴5 min，解离后水洗2～3次，晾干1 min，再放入卡宝品红染色液中染色1 h以上。取已染色的根尖分生区前端置于载玻片上，滴加适量的45%醋酸后制片。使用Leica DM2000显微镜观察20个以上的细胞，选取染色体形态清晰、分散性好的3～5个中期细胞拍照并统计染色体数目。

2 结果与分析

2.1 蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片的细胞核悬浮液的制备和优化

为获得适合蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片的细胞核解离液，本研究以巨型蜘蛛抱蛋和四倍体辐花蜘蛛抱蛋的成熟叶片为材料，比较WPB、LB01、Galbraith’s以及改良Galbraith’s共4种细胞核解离液的裂解效果。在二倍体巨型蜘蛛抱蛋中，利用4种解离液制备的细胞核悬液的颜色均为绿色。在四倍体辐花蜘蛛抱蛋中，使用WPB和改良Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液为绿色，而使用LB01以及Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液为红褐色（图1）。

通过流式细胞仪测定发现，在巨型蜘蛛抱蛋中使用WPB解离液的获得的细胞碎片多，无DNA主峰，裂解效果差（图2-a）；而使用LB01解离液、Galbraith’s解离液以及改良Galbraith’s解离液可获得DNA峰，其变异系数CV均值分别为4.39%、3.64%、3.45%（图2-b～2-d）。可见，使用LB01解离液、Galbraith’s解离液以及改良Galbraith’s解离液均可用于制备巨型蜘蛛抱蛋的细胞核悬液且效果较好，其中改良Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液效果最好。

四倍体辐花蜘蛛抱蛋的流式细胞仪测定的结果表明，WPB解离液、LB01解离液以及Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液均无法获得DNA峰（图2-e～2-g），而改良Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液可获得DNA峰，其变异系数CV均值为2.82%（图2-h）。

可见，改良Galbraith’s解离液能够更广泛地适用于蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片的细胞核悬液的制备且效果较好。

2.2 蜘蛛抱蛋属植物的倍性鉴定

使用改良Galbraith’s解离液制备12种13个居群的蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片的细胞核悬液，通过流式细胞术检测12种蜘蛛抱蛋属植物的倍性（图3）。结果表明，12种蜘蛛抱蛋属植物DNA荧光强度峰值均值的范围为1 753 078～ 5 817 827，变异系数均值为2.75%～5.26%，均小于8%，说明试验样品的数据质量可信度高，检测结果准确（表3）。

以二倍体的辐花蜘蛛抱蛋为外标（图3-k），发现10种蜘蛛抱蛋属植物的DNA含量荧光强度的峰值均值与对照样本的DNA含量荧光强度的峰值均值接近，其峰值均值范围为1 753 079～2 937 691，DNA含量比值范围为0.75～1.25，估测为二倍体；辐花蜘蛛抱蛋的DNA含量荧光强度峰值均值分别为2 342 050和3 892 505，其DNA含量比值为1和1.66，分别位二倍体和四倍体；泰国蜘蛛抱蛋的DNA含量荧光强度峰值均值为5 817 827，其DNA含量比值为2.48，为六倍体。

2.3 常规染色体制片计数法的结果

本研究利用常规染色体制片计数法验证流式细胞术的倍性鉴定结果，结果表明10种蜘蛛抱蛋属植物为二倍体，其染色体数目分别为2n=36 或2n=38；辐花蜘蛛抱蛋存在二倍体和四倍体，染色体数目分别为2n=38和2n=76；泰国蜘蛛抱蛋为六倍体，染色体数目为2n=114（图4）。染色体制片计数法的倍性检测结果与流式细胞术的检测结果一致。

2.4 12种蜘蛛抱蛋属植物核DNA含量

以葱作为内部参照，通过流式细胞仪测定蜘蛛抱蛋属12种13个居群植物的细胞核DNA荧光强度（图5）。通过计算可知（表4），12种蜘蛛抱蛋属植物的核DNA含量为14.16 Gb～43.03 Gb。其中，二倍体蜘蛛抱蛋属植物的核DNA含量为14.16 Gb～18.73 Gb；长药蜘蛛抱蛋的核DNA含量最小，为14.16 Gb；小花蜘蛛抱蛋的核DNA含量最大，为18.73 Gb。四倍体辐花蜘蛛抱蛋的核DNA含量为28.33 Gb，六倍体泰国蜘蛛抱蛋的核DNA含量为43.03 Gb。蜘蛛抱蛋属13个不同居群植物的核DNA含量的方差分析表明（表4），该属的六倍体泰国蜘蛛抱蛋和四倍体辐花蜘蛛抱蛋的核DNA含量存在显著性差异 （P<0.05），六倍体泰国蜘蛛抱蛋、四倍体辐花蜘蛛抱蛋与其他二倍体物种的核DNA含量存在显著性差异（P<0.05）。

3 讨论与结论

流式细胞仪成功鉴定植物倍性的关键在于制备高质量的单颗粒细胞核悬液，而影响细胞核悬液制备的主要因素是植物材料和细胞核解离液[35-37]。在进行细胞流式试验测定时，大多使用嫩叶作为制备材料，并配合使用特定的细胞核解离液，以获得高质量的单颗粒细胞核悬液。本研究中，由于受到植物生长发育周期的限制，不易获得蜘蛛抱蛋属植物的嫩叶，因此需要筛选出适合于裂解成熟叶片的裂解液。WPB、LB01、Galbraith’s为常用的细胞核解离液。在本研究中，WPB解离液不适用于制备蜘蛛抱蛋属植物成熟叶片的细胞核悬液，LB01、Galbraith’s解离液对巨型蜘蛛抱蛋的解离效果较好。变异系数（CV）作为检测经流式细胞仪分析细胞核悬液所形成直方图中DNA峰的数据准确性的主要指标，其值越小，数据准确性以及可靠性越高。因此，通过比较DNA峰的变异系数CV值，发现Galbraith’s解离液的效果最好。然而，利用LB01、Galbraith’s解离液制备辐花蜘蛛抱蛋的成熟叶片细胞核悬液时均发生褐化现象。为了找到适用于辐花蜘蛛抱蛋的细胞核解离液，本研究对Galbraith’s解离液的配方进行改良，改善了细胞核悬液制备过程中的褐化现象。此外，经改良Galbraith’s解离液制备的细胞核悬液还可普遍用于蜘蛛抱蛋属的其他种类，且解离效果优于其他解离液。

在流式细胞分析试验中，标准物的选择对检测植物的核DNA含量非常重要。早期研究中，应用流式细胞术测定核DNA含量时多选用鸡红细胞作为内标[38]。但Johnson等[39]认为应用流式细胞术的检测对象为植物时，应当选择植物材料作为检测核DNA含量的内标。对于内标植物的选择，应选择已知DNA含量且稳定，与待测植物的核DNA含量接近[36]。本研究选择了已完成全基因组测序的葱[34]作为内标植物，经试验获得的内标峰与待测样品峰易于区分。Bharathan等[28]曾报道蜘蛛抱蛋的核DNA含量约为17.90 Gb，与本研究中获得的蜘蛛抱蛋的核DNA含量的结果相近。可见，基于流式细胞术的蜘蛛抱蛋属植物核DNA含量的测定数据可靠，重复性高。

本研究以成熟叶片作为试验材料，通过对Galbraith’s解离液的改良，分别选择辐花蜘蛛抱蛋作为外标植物、葱作为内标植物，建立了一套适用于蜘蛛抱蛋属植物倍性检测和核DNA含量测定的体系，首次报道了11种蜘蛛抱蛋属植物的核DNA含量，为该属植物的遗传育种研究、全基因组研究以及喀斯特植物的起源与演化研究提供重要科学依据。

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Establishment of a System for Estimating Ploidy Level and Nuclear DNA Content of Aspidistra Baed on Flow Cytometry

CHEN Tingting1，2，MA Junpeng1，HUANG Yingying1，LIANG Guibing1，ZHOU Hao1 and GAO Qi1

（1.School of Marine Sciences and Biotechnology，Guangxi Minzu University，Nanning 530006，China;2.Nanning Nornal Universisty，Nanning 530001，China）

Abstract To establish a flow cytometry method for determining the ploidy level and nuclear DNA content in the genus Aspidistra，we compared the effects of nuclear suspension prepared with WPB buffer，LB01 buffer，Galbraith’s buffer and modified Galbraith’s buffer with the mature leaves.The results showed that the modified Galbraith’s buffer could be more widely and effectively applied to prepare nuclear suspension of mature leaves of Aspidistra.Using the modified Galbraith’s buffer，we detected and verified ploidy level of 12 species from 13 populations within this genus using chromosome counting method.The peak fluorescence intensity of DNA content of 12 species ranged from 1 753 078.81 to 5 817 826.99.Among these，the peak value of 11 diploid plant ranged from 1 753 078.81 to 2 937 690.80，while the tetraploid A.subrotata was 3 892 503.69，and the hexploid A.sutepensis was 5 817 826.99.In addition，the nuclear DNA content of the above plants was measured using Allium fistulosum as internal standard.The nuclear DNA content of 11 species of plants was estimated for the first time，and the DNA content of A.elatior was similar to the reported results.The nuclear DNA content of diploid plants ranged from 14.16 to 18.73 Gb，the tetraploid&nbsp; A.subrotata was 28.33 Gb，and the hexaploid A.sutepensis was 43.03 Gb.The results of this study provide an important scientific basis for the research of genetic breeding，whole-genome research，and the exploration of the origin and evolution of karst plants.

Key words Aspidistra; Chromosome number; Flow cytometry; Ploidy level; Nuclear DNA content

Received 2023-09-29 Returned 2023-11-27

Foundation item The National Natural Science Foundation of China （No.31560056）;Research Start-up Project of Guangxi Minzu University （No.2018KJQD15）.

First author CHEN Tingting，female，master student.Research area：botany.E-mail：1779894174@qq.com

Corresponding author GAO Qi，female，Ph.D，research fellow.Research area：botany.E-mail：qigao_qg@foxmail.com

（责任编辑：潘学燕 Responsible editor：PAN Xueyan）

基金项目：国家自然科学基金（31560056）；广西民族大学引进人才科研启动项目（2018KJQD5）。

第一作者：陈婷婷，女，硕士研究生，研究方向为植物学。E-mail：1779894174@qq.com

通信作者：高 乞，女，博士，研究员，研究方向为植物学。E-mail：qigao_qg@foxmail.com