循环肿瘤细胞在现代中医肿瘤临床研究中的应用分析

摘要：液体活检（LB）为新一代检测技术，能更准确地评价肿瘤患者疾病进展，从而为肿瘤防治提供临床应用价值。目前，循环肿瘤细胞（CTC）是液体活检最具潜力的研究方向之一。中医治未病思想贯穿中医药治疗疾病的始终，且中医药在肿瘤临床诊疗中发挥越来越重要的作用。主要综述现有CTC的富集策略以及CTC技术在中医药领域应用现状，以期将现代肿瘤生物学应用在中医药防治肿瘤，建立中西医结合模式的中医理论指导与西医技术模型，为中西医肿瘤临床诊疗提供新模式。

关键词：循环肿瘤细胞；中医药；富集技术；精准医学；液体活检

19世纪30年代，Steven Paget[1]提出的“种子和土壤”假说形象地阐明了癌症转移过程。传统的癌症诊断金标准是组织活检，但这种方法在大多数肿瘤的诊断和治疗中存在局限性，比如创伤性和耗时性。近年来，液体活检成为个体化“精准医学”重要手段之一[2]。与组织活检相比，液体活检具有许多优点，包括样本采集方便、操作可重复、信息全面等。因此，液体活检已经成为可以用于癌症筛查诊断、治疗进展监测和预后评估的一个重要手段。在液体活检中，与碎片化的ctDNA和外泌体相比，CTC具有完整的细胞形态，能提供关于肿瘤遗传物质变化的大部分信息。同时，通过观察CTC在形态上的变化、迁移能力以及药物敏感性试验等方面，可以对肿瘤的发生、转移和耐药机制进行研究[3]。但CTC检测仍存在诸多挑战，如CTC数量极少，尤其是混合在数量级相差巨大的血细胞中，如何实现识别并富集CTC而不吸附大量的血细胞，是CTC检测最关键的难题；CTC与大多数肿瘤浸润灶类似，存在很强的异质性[4]。

1CTC的富集策略

目前，主要的CTC识别方式主要有两种：一种是根据细胞的生物物理特性，如尺寸大小、密度差异来物理识别CTC，通过物理特性识别CTC对细胞损伤小，分离出来的CTC在体外培养成活率高，有利于进行下一步单细胞组学分析，但识别效率较低，特异性较差；另一种则是通过确定CTC表面的蛋白标志物差异，通过将能与受体相结合的配体修饰在芯片或带有磁性的磁珠表面，基于配体与受体高亲和力的结合富集CTC，称为免疫富集。

1.1 免疫磁珠富集

免疫磁珠富集中包括CellSearch®为代表的多种磁分离方法，也是最经典的CTC富集方法。其中，CellSearch®是唯一通过FDA认证的CTC富集策略，也是目前CTC检测的金标准。该系统采用包被上皮细胞黏附分子（EpCAM）的铁纳米流体粒子来富集EpCAM阳性的CTC，EpCAM也是免疫磁珠富集中最常用的靶标分子。该方法的优势是可以稳定高效富集CTC，但局限性明显，只能富集EpCAM高表达的CTC。在实际样本检验中会发现，许多CTC处于上皮-间质化（EMT）的动态转化过程，在此期间，CTC会根据定植或转移的需要动态调整上皮型与间质型的蛋白表达量，如部分或完全下调EpCAM、钙黏蛋白E（E-cadherin）和细胞角蛋白（CK）等上皮标志物，对间质特异性标志物，如波形蛋白和钙黏蛋白N（N-cadherin进行上调，这与 EMT 相关转录因子 Slug、Snail和 Twist的表达增加有关[5]。据报道，与上皮细胞相比，这些间充质CTC具有更高的转移性，是更具侵袭性的转移亚群[6]。因此，仅根据 EpCAM 表达来分离 CTC， 可能会导致 CTC 计数不准确，且磁分离的方法会对细胞产生损伤，从而限制CTC下游分析。

1.2 免疫微流控富集

免疫微流控富集技术是近年来发展极为迅速的CTC富集技术，该技术是通过将血液以一定的速度流经设计有微通道的芯片内部，在芯片内部通道中基于免疫标记物或根据细胞尺寸大小来分离血细胞与CTC，不仅可以提高CTC与微通道内部有抗体或其他配体修饰表面的接触表面积，还可以提高回收细胞的存活率。但微流控富集的方法也存在局限性，由于微流体芯片需要控制样本流入速度，大大增加了样品处理以及分析的时间，且微流体芯片通量较小，一次只能处理较少的血液样品。

1.3 生物物理特性富集

生物物理特性富集主要是根据细胞尺寸大小、介电性以及密度等差异来分离CTC与血细胞，主要代表方法有以下几种。

（1）经膜过滤法 ：CTC直径一般在8～30 μm，而血细胞直径为12～15 μm，远小于CTC，利用这种方法可将尺寸较小的血细胞拦截在膜表面。富集CTC保留了CTC的异质性，且廉价、操作简便，但膜过滤系统通常容易堵塞，且富集到的CTC纯度较低。

（2）微流体过滤法：根据细胞不同尺寸设计的阶梯式过滤法以及螺旋上升式微流控系统，能够根据CTC不同尺寸优化分离，并且可以捕获到CTC簇[7]。由于生物物理特性富集法不依赖于免疫靶标，这种方法可以同时捕获间充质型和上皮型CTC，保留了CTC群体的异质性，并扩大了临床实用性，使其能够从所有癌症类型中捕获CTC，而不仅限于上皮癌。由于没有抗体等配体标记，生产成本通常较低。但它们的通量通常相当低，处理时间较慢，且大多数设备一次只能处理一个样品。由于血细胞在尺寸上与CTC的重叠区域，降低了富集到的CTC纯度。但是，生物物理特性富集仍然是CTC分离领域的重要组成部分。

2CTC在临床实际应用现状

尽管在CTC富集策略中已经有了许多前沿性研究，CTC临床研究积累了大量循证医学研究证据，但仍没有临床指南将CTC检测纳入临床应用，说明这些富集策略仍然需要大规模的临床验证。目前只有CellSearch®系统可用于临床检验，其他富集策略虽然展现了诸多优势，但将CTC检测转化为常见的临床检验仍然缺乏说服力，主要原因仍是目前CTC检测的方法尚未标准化以及对CTC所携带的关键信息分析，这些信息中可能揭示了癌症转移机制，包括CTC从原发肿瘤外渗的机制、CTC如何与血细胞相互作用以在循环微环境中生存，以及 CTC如何内渗到远处的转移部位以引发新的病变。

CTC的重要分子特征可大大有助于确定抗转移疗法的靶点。只有一小部分 CTCs 能最终产生转移，针对这些强转移性CTC的研究有望成为癌症治疗的新靶点。尤其是将生物物理特性与免疫分离相结合的分离方法，会是未来主要的发展方向。尽管在临床上，CTCs作为癌症筛查、治疗监测和预后预测的替代生物标志物的应用仍然有限，但其在癌症诊断临床应用中的巨大潜力已经显现。一旦发生转移，通常难以获得转移病灶的重复活检，即使在同一患者身上，不同的转移灶也存在异质性。使用外周血样本检测 CTCs 不仅方便，而且可能更具代表性。

3CTC在中医辨证肿瘤应用研究

大多数肿瘤早期无明显症状，这大大增加了临床诊治难度。CTC作为现代肿瘤生物学与分子生物学最热门的领域之一，可以为中西医在研究肿瘤的发病机制中提供客观依据。尤其是如今中医在临床防治肿瘤发挥越来越重要作用，将前沿肿瘤研究融进中医学理论研究与实际临床辨证应用，促对进中西医结合发展具有重要意义。

3.1 CTC与肿瘤病因病机

“癌毒”学说在20世纪末由国医大师周仲瑛首先提出，认为其属于中医学“毒邪”范畴。20世纪70年代，国医大师刘嘉湘先生通过将对中医学理论研究与现代肿瘤生物学研究相结合，提出了“扶正致癌”的防治肿瘤理念，认为肿瘤的发生主要是由于人体正气不足，外邪乘人体之虚，与内伏之邪毒共同引起人体的阴阳失调、气血运行障碍，导致寒凝、痰瘀、气滞血瘀等一系列病理因素。现代肿瘤临床中，早期注重肿瘤组织与细胞减灭，如放、化疗等技术。这与中医中的攻伐法较为类似，但此种方法对人体正气损伤较大，正气损伤必定进一步导致邪毒进入机体，而正气已虚，无力抵御，因而经过放化疗的肿瘤患者免疫系统功能低下。在临床肿瘤诊治中，注重免疫功能维护有助于预防肿瘤复发转移，改善患者预后，这也与中医理论中扶正的内涵相似，和毒邪具有流窜性、隐匿性的特点相符合。“伏邪”理论源于《内经》。田建辉教授等研究发现，CTC在肺癌复发与转移中的作用与“邪气伏藏，待时而动”蕴含的病因病机有重合之处，并在此基础上提出了“正虚伏毒”致癌的观点。

3.2 CTC与中医辨证分型的关系

肿瘤患者由于肿瘤的发展状态不同，中医辨证分型也处于动态变化的过程中。中医理论中，同病异治与异病同治体现了辨证分型的重要性。不同肿瘤的病因都由邪毒引起，但因个人体质与机体所处的环境不同，需通过整体观念与个体辨证相结合治疗肿瘤。但肿瘤的中医辨证分型各家尚未统一，CTC的表征可能为中医证型建立统一标准提供参考数据。吴娇发现，舌质紫红有瘀斑的患者CTC数量更多。这些研究表明，CTC数量可能与中医辨证肿瘤中一些证型存在一定的相关性。

3.3 CTC对中医药的疗效评价

中医治未病思想贯穿疾病治疗的始终，强调“未病先防，已病防传”。因CTC在肿瘤早期可能已经开始了血行转移过程，因此CTC检测能够在肿瘤早期影像学检查未出现可疑病灶前提供筛查技术手段。而在肿瘤治疗后，CTC检测能够通过治疗前后的数量变化判断药物或治疗手段的疗效。胡燕勤等通过对比经大柴胡汤联合化疗前后的患者CTC数量发现，大柴胡汤能有效减轻化疗后副作用，延长患者生存期。李长洋发现，健脾化积方可以抑制肿瘤细胞增殖与侵袭，从而抑制肺癌转移。顾寄树等发现，康莱特中药注射剂联合化疗后的患者CTC数量更低。陆恩昊研究发现，中药金复康口服液可以显著循环肿瘤细胞的成簇能力。毛竹君等发现，四藤方应用于胃癌术后中西医结合治疗后，可显著下调CTC数量。对CTC的研究，可能为中药防治肿瘤复发转移提供细胞生物学基础。

4讨论与展望

循环肿瘤细胞在中医主要研究方法有前瞻性与回顾性队列研究，随机对照试验仍然缺乏多中心大样本的数据，CTC富集策略的灵敏性与特异性仍然需要进一步提高。CTC检测未形成自动化、标准化检测，还无法作为临床检验手段。在液体活检中，CTC检测具有巨大优势，分离后的CTC可以进行培养或下游分析。另外，在CTC周围的血液及其他微环境研究中，也存在着肿瘤存活与转移侵袭的奥秘。中医在肿瘤中的证候分析尚未建立一致的诊疗规范，导致CTC研究多以中药作用机理与临床疗效观察居多，对于辨证分型的研究较少。今后应对肿瘤的证型展开规范化、一致化分析，推动中医药在现代肿瘤学中的发展。

参考文献

[1]阿依达娜·毛兰，刘瑞，花宝金.基于“寒气生浊”理论探微癌性疼痛的机制与治疗[J].世界中医药，2023，18（22）： 3224-3228.

[2]王红兵.液体活检在恶性肿瘤中的应用[J].实用医院临床杂志，2022，19（5）：198-202.

[3]杨小周，张灵强，王凯强，等.循环肿瘤细胞与循环肿瘤DNA在肝细胞癌中的研究进展[J].河北医药，2023， 45（3）：446-450.

[4]张竹萍，叶琪，郭蓓，等.叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测在喉鳞状细胞癌诊断中的应用价值[J].山东大学耳鼻喉眼学报，2023，37（5）：50-53.

[5]韩雪，李帅，徐蓉，等.上皮间质转化相关基因水平评估肝癌免疫治疗疗效的应用价值[J].国际检验医学杂志，2023，44（23）：2914-2918.

[6]崔宏伟，苏秀兰.上皮细胞向间充质细胞转变在肝癌进程中的作用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2019， 28（3）：281-286.

[7]赵霄，刘文娟，李磊，等.不同孔径微孔滤膜富集肿瘤细胞的方法[J].中国生物医学工程学报，2018，37（6）：765-768.