参苓白术汤中5种成分HPLC含量测定方法研究

摘要：目的 建立参苓白术汤中人参皂苷Rg1、Re、Rb1和甘草苷、甘草酸铵的含量测定方法。方法 建立高效液相色谱法分别测定参苓白术汤中人参皂苷Rg1、Re、Rb1和甘草苷、甘草酸铵的含量并进行方法学考察。结果 在所建立色谱条件下，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、甘草苷、甘草酸铵分别在29.79～297.85 μg·mL-1，21.76～217.57 μg·mL-1，22.87～228.66 μg·mL-1，9.79～195.80 μg·mL-1，57.85～1156.92 μg·mL-1范围内均呈现出良好的线性关系，其RSD值均大于0.9990；加样回收率分别为99.00%、101.56%、99.06%、104.89%和104.00%，RSD分别为2.85%、2.99%、2.31%、1.03%和0.62%。 结论 所建立的高效液相色谱检测专属性高，线性关系、精密度、稳定性均良好，可用于参苓白术汤中人参皂苷Rg1、Re和Rb1以及甘草苷、甘草酸铵的含量测定。

关键词：参苓白术；汤剂；高效液相色谱法；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；甘草苷；甘草酸铵

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2024）09-0075-04

参苓白术散源于《太平惠民和剂局方》，由人参、茯苓、炒白术、山药、炒白扁豆、莲子、炒薏苡仁、砂仁、炒桔梗和炙甘草配伍而成，具有益气健脾、渗湿止泻之功，是历代调脾之主方［1］，可用于脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力的治疗。除散剂外，临床和科研中还常使用参苓白术的汤剂、丸剂、颗粒剂等剂型以适应不同需要。但目前仅可见散剂、丸剂和颗粒剂的高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）含量测定方法的文献报道，未见汤剂的含量测定方法的报道［2-7］。故本研究建立了两种HPLC检测方法分别应用于参苓白术汤中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量测定以及甘草苷、甘草酸铵的含量测定，以期为参苓白术汤的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪（美国安捷伦）；Secura2250分析天平（德国赛多利斯）；Cf16RXII离心机（日本日立工机）。

1.2 试剂与药品 人参皂苷Rg1对照品（批号：PS012772）、人参皂苷Re对照品（批号：PS012036）、人参皂苷Rb1对照品（批号：PS012770）、甘草苷（批号：PS011508）、甘草酸铵（批号：PS011619），均购置于成都普思生物科技股份公司。中药材（人参，批号：230401；茯苓，批号：230601；炒白术，批号：230301；山药，批号：230203；炒白扁豆，批号：230302；莲子，批号：230201；炒意苡仁，批号：230402；砂仁，批号：230506；炒桔梗，批号：230105；炙甘草，批号：230601）购自于云南慧慈药业有限公司，经鉴定为正品。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6～250 mm，5 μm）；检测波长：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：20℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱程序：0～20 min，5% A→19% A；20～30 min，19% A；30～75 min，19% A→20% A；75～85 min，20% A→30% A；85～125 min，30% A→35% A。

2.1.2 甘草苷、甘草酸铵 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6～250 mm，5 μm）；检测波长：237 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：20℃；进样量：5 μL；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0～6 min，22% A；6～7 min，22% A→33% A；7～31 min，33% A→39% A。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 按2020年版中国药典参苓白术散原处方比例（人参∶茯苓∶炒白术∶山药∶炒白扁豆∶莲子∶炒薏苡仁∶砂仁∶炒桔梗∶炙甘草配伍比例为4∶4∶4∶4∶3∶2∶2∶2∶2∶4）称取药材。人参加10倍量水浸泡过夜后回流提取1 h，纱布过滤；再加10倍量水提取1 h，纱布过滤。其他药材混合后亦回流提取两次，第一次加10倍量水浸泡1 h后回流提取1 h，纱布过滤；第二次加10倍量水回流提取1 h，纱布过滤。所有滤液混合，减压浓缩至1 g生药/mL。浓缩液4500 r/min离心10 min，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 人参皂苷Rg1、Re、Rb1混合对照品溶液：精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1 0.5957 mg、Re 0.4351 mg、Rb1 0.4573 mg的混合对照品溶液，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

甘草苷、甘草酸铵混合对照品溶液：精密称取甘草苷和甘草酸铵对照品适量，加甲醇制成每1 mL含甘草苷0.1958 mg和甘草酸铵1.1569 mg的混合对照品溶液，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液按“2.1”项下的色谱条件进行HPLC检测，分别记录各成分的色谱图，考察分析方法专属性，检测结果表明专属性良好。详见图1、图2。

2.4 线性关系考察 分别精密量取人参皂苷Rg1、Re、Rb1混合对照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mL置于5 mL容量瓶中，甲醇定容。分别精密量取甘草苷、甘草酸铵混合对照品溶液0.1、0.3、0.5、1.0、2.0 mL置于2 mL容量瓶中，甲醇定容。按“2.1”项下色谱条件进行分析。以待测成分浓度（X，μg/mL）为横坐标，以对应峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程及相关系数（r），结果见表1。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下人参皂苷Rg1、Re、Rb1混合对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1峰面积RSD值分别为0.11%、0.68%和0.72%，表明仪器精密度良好。

精密吸取“2.2.2”项下的甘草苷、甘草酸铵混合对照品溶液5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果甘草苷和甘草酸铵峰面积RSD值分别为0.97%和0.86%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验（中间精密度试验） 精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件于0、3、6、12、24、48 h分别进样测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面积，RSD值分别为2.35%、2.71%、1.31%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1.2”项下色谱条件于0、3、6、12、24 h分别进样测定甘草苷和甘草酸铵的峰面积，RSD值分别为0.44%和0.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 按“2.2.1”项平行制备6份供试品溶液，分别进样10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面积，依据“2.4”项中的线性回归方程计算6份供试品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。结果显示人参皂苷Rg1、Re、Rb1平均含量分别为117.30 μg /g、80.42 μg /g、144.75 μg /g，RSD值分别为1.70%、0.81%和1.75%，表明该方法的重复性良好。

按“2.2.1”项平行制备6份供试品溶液，分别进样5 μL，按“2.1.2”项下色谱条件测定甘草苷和甘草酸铵的峰面积，依据“2.4”项中的线性回归方程计算6份供试品中甘草苷和甘草酸铵含量。结果显示甘草苷和甘草酸铵平均含量分别为46.94 μg/g、290.44 μg/g，RSD值分别为2.22%和1.16%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的参苓白术汤6份，按照1∶1比例加入人参皂苷Rg1、Re和Rb1对照品，按“2.2.1”项制备供试品溶液，并按“2.1.1”项色谱条件进行分析。计算回收率，人参皂苷Rg1、Re和Rb1的平均回收率分别为99.00%（RSD=2.85%），101.56%（RSD=2.99%），99.06%（RSD=2.31%），表明该方法准确性良好。结果见表2。

取已知含量的参苓白术汤6份，按照1∶1比例加入甘草苷、甘草酸铵对照品，按“2.2.1”项制备供试品溶液，并按“2.1.2”色谱条件进行分析。计算回收率，甘草苷和甘草酸铵的平均回收率分别为104.89%（RSD=1.03%），104.00%（RSD=0.62%），表明该方法准确性良好。结果见表2。

2.9 含量测定 按“2.2.1”项制备供试品溶液2份，按“2.1”项色谱条件测定含量。结果见表3。

3 讨论

参苓白术散是健脾渗湿经典方剂，除散剂外、还常使用汤剂、丸剂、颗粒剂等剂型以适应不同的临床和科研需要。目前仅见文献报道散剂、丸剂和颗粒剂的含量测定方法，未见汤剂含量测定方法的报道［2-7］。故本研究拟开发参苓白术汤的含量测定方法并进行方法学考察。

人参为该方君药，其中人参皂苷Rg1、Re、Rb1为其主要活性成分，《中华人民共和国药典》（2020年版）中也将这三个指标作为人参的含量测定指标成分。又通过查阅《中华人民共和国药典》（2020年版）和文献［2-9］，选取甘草中的甘草苷与甘草酸铵，与人参皂苷Rg1、Re、Rb1一同作为该方的含量测定指标成分。此外，本研究尝试在一个色谱条件下同时分析5种成分，但因3种人参皂苷成分和2种甘草成分结构性质的差异，分离度不佳，故开发了2种分析方法分别测定，以得到更好的分离效果。本研究还对色谱柱进行了考察，在同样色谱条件下Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6250 mm，5 μm，Agilent）色谱柱对上述5种成分的分离效果优于Zorbax SB-C18（4.6250 mm，5 μm，Agilent），故选择使用前者。

综上所述，本研究所建立的参苓白术汤中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的HPLC含量测定方法以及甘草苷、甘草酸铵的HPLC含量测定方法专属性高，线性关系、精密度、准确度、稳定性均良好，可用于参苓白术汤中上述5种成分的含量测定，可为参苓白术汤的质量控制提供参考。

参考文献：

［1］鹿岩，化晓凯，张红艳，等.经典名方参苓白术散的古今文献考证及研究热点分析［J］.中国药房，2023，34（12）：1449-1455.

［2］刘彩君，朱芹.参苓白术散高效液相色谱特征指纹图谱研究及5个指标性成分的含量测定［J］.中国药业，2018，27（15）：12-16.

［3］王雪梅，李艳娇，宋燕青.基于高效液相指纹图谱检测参苓白术散中人参皂苷的含量测定［J］.世界中医药，2018，13（11）：2876-2879+2883.

［4］王登旭，赵文法，王洪梅.HPLC测定参苓白术丸中人参皂苷的含量［J］.食品与药品，2020，22（1）：29-32.

［5］周芳.HPLC法测定参苓白术颗粒中人参皂苷的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2006（2）：16-17.

［6］王二兵，曲婷丽，赵正保.HPLC法测定参苓白术颗粒中甘草酸的含量［J］.山西医科大学学报，2008（1）：38-40.

［7］邵维在，段治尚，万德生，等.参苓白术颗粒质量标准研究［J］.大理大学学报，2016，1（2）：5-9.

［8］张府君，甄会贤，仝立国，等.一标多测法同时测定参苓白术颗粒中5种成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2021，38（11）：1144-1151.

［9］卢广英，邢训颜，王嘉昀，等.经典名方参苓白术散的研究进展及质量标志物的预测分析［J］.中国中药杂志，2022，47（19）：5171-5181.

（收稿日期：2024-03-08）