抗衰延年方对衰老大鼠学习记忆及细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax表达的影响

摘要：目的 通过观察抗衰延年方对衰老大鼠细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax表达的影响，探讨抗衰延年方延缓衰老的可能机制。方法 健康SD雄性大鼠40只，将其随机分为正常组、衰老模型组、中药组和吡拉西坦组；正常组不做任何处理，衰老模型组、中药组和吡拉西坦组每日颈背部皮下注射D-半乳糖500 mg/kg，连续注射30 d；经过30 d治疗后以Morris 水迷宫进行大鼠行为学测试后取材应用原位杂交法检测其Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠行动迟缓，逃避潜伏期增多（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表达降低（P<0.05），Bax mRNA的表达增高（P<0.05）；与模型组相比，中药组大鼠活力增强，逃避潜伏期时间减少（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表达增强（P<0.05），Bax mRNA的表达降低（P<0.05）。结论 抗衰延年方可改善衰老大鼠空间学习记忆能力，其机制可能与其上调抑制细胞凋亡因子Bcl2表达，下调促凋亡关键因子Bax表达有关。

关键词：抗衰延年方；衰老；原位杂交法；Bcl-2/Bax；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2024）09-0071-04

Effects of Anti-aging and Life-prolonging Prescription on the Expression of Learning

and Memory and Apoptosis-related Factors Bcl-2 and Bax in Aging Rats

LI Zhi-liang， ZHOU Min， TANG Zhong-sheng， MENG Xiao， WANG You-qian， WEI Jie-yin

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Anti-aging and Life-prolonging Prescription on the expression of apoptosis-related factors Bcl-2 and Bax in aging rats， and to explore the possible mechanism of the prescription. Methods： 40 healthy SD male rats were randomly divided into normal group， aging model group， TCM group and piracetam group. The normal group was not treated， and the aging model group， TCM group and piracetam group were injected with 500 mg/kg D-galactose subcutaneously daily on the neck and back for 30 days. After 30 days of treatment， Morris water maze was used to conduct behavioral tests on the rats， and Bcl-2 mRNA and Bax mRNA expression were detected by in situ hybridization. Results： Compared with the rats in the normal group， the rats in the model group acted slowly， the escape latency increased （P<0.05）， the expression of Bcl-2 mRNA decreased （P<0.05）， and the expression of Bax mRNA increased （P<0.05）. Compared with that of the model group， the activity of rats in the TCM group increased， the escape latency time decreased （P<0.05）， the expression of Bcl-2 mRNA increased （P<0.05）， and the expression of Bax mRNA decreased （P<0.05）. Conclusion： Anti-aging and Life-prolonging Prescription can improve the spatial learning and memory ability of aging rats， and its mechanism may be related to the up-regulation of the expression of anti-apoptotic factor Bcl2 and the down-regulation of key pro-apoptotic factor Bax.

【Key words】Anti-aging and Life-prolonging Prescription; Aging; In Situ Hybridization; Bcl-2/Bax; Rat

衰老与年龄的增长呈正相关性，并伴随着机体各组织功能衰退的自然生理过程，但是在内外众多因素的刺激下，或加快，或减慢这一进程，正如每个人寿命的不同。现今老龄化是社会经济发展的必然趋势，而全国人口普查结果也表明我国已步入老龄化社会，因此由老龄化所带来的一系列问题对中国经济社会的发展产生深远的影响［1］，故对衰老的研究对于社会具有重要的意义。目前关于抗衰老的研究设计的学说中，主要分为两大类：机体衰老和细胞衰老［2］。导致细胞衰老主要是由体内相关的基因表达蛋白调控，其相关蛋白通过裂解进入细胞核，通过发挥基因转录功能，从而诱导细胞衰老、凋亡的发生［3］。同时在调控细胞凋亡的过程中，抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（B lymphocytoma-2，Bcl-2）和促凋亡蛋白B-淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B lymphocytoma-2 associated X protein，Bax）具有非常重要的作用。而Bcl-2属于抗细胞凋亡家族成员，可以调节细胞凋亡因子Bax的表达；与此同时，Bax又可以与Bcl-2结合成二聚体，影响细胞的凋亡，降低Bax表达，可以抑制凋亡复合体的形成［4］。本实验拟通过观察抗衰延年方对D-半乳糖所致衰老模型大鼠脑组织中Bcl-2和Bax的相关表达，探索抗衰延年方调控细胞凋亡的作用及延缓细胞衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠40只，体质量280～300 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0014。

1.1.2 药物与试剂 自拟抗衰延年方：党参、黄芪、白术、陈皮、枸杞、红枣等（购于贵阳同仁堂店）；吡拉西坦（多多药业有限公司，20160911）；D-半乳糖（上海国药集团化学试剂有限公司，20200623），Bc1-2原位杂交检测试剂盒（Servicebio，GF003-50T），Bax原位杂交检测试剂盒（Servicebio，GF003-50T）。

1.1.3 仪器与设备 电子分析天平（日本岛津，AUW-220D）；转轮式切片机（德国，徕卡-2016）；全自动封闭式组织脱水机（TSJ-Ⅱ）、包埋机（BMJ-Ⅲ）、病理组织漂烘仪（PHY-Ⅲ）（常州市中威电子仪器有限公司）；数码三目摄像显微镜（BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司）等；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）；立式超低温保存箱（Haier，DW 86L386）；高速冷冻离心机（湘仪贝克，TGL-20M）；Morris水迷宫测试分析软件（荷兰Nodule公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备 将适应性喂养1w后的大鼠参考秦红兵等方法［5］，每日颈背部皮下注射D-半乳糖500 mg/kg，连续注射30 d，进行造模。模型制作成功后，除去饲养和造模过程中死亡的8只大鼠，剩余的大鼠随机分为模型组、抗衰延年方组（简称为中药组）、吡拉西坦组（简称为西药组）、正常对照组，各8只。

1.2.2 干预方法 （1）中药组：每日1次给予抗衰延年方水煎剂灌胃治疗，每次10 mL·kg-1。连续21次。（2）西药组：隔日1次，给予10 mg·kg-1吡拉西坦灌胃治疗。连续21d。（3）正常对照组和模型组：常规饲料喂养，不予其他干预性饲料。

1.2.3 Morris水迷宫行为学测试 Morris水迷宫为圆形水池，直径100 cm，深50 cm，水深30 cm，水温（24±2）℃，池壁上4个等距离点分水池为四个象限，选第三象限在其中央放置平台，平台无色透明，直径6 cm，高28 cm，平台没于水面下2 cm，水池周围参照物保持不变。第1～6 d 进行定向航行实验，每日将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的顺序从各入水点（各象限水池壁中点）靠池壁放入水中，记录60 s内大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期；第7 d行空间探索实验，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录90 s内大鼠在第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数。

连续7d定位航行实验，记录大鼠从入水到找到平台后四肢爬上平台并停留超过2s所需的时间，即逃避潜伏期时间。设定时间为90s，如90s后仍未找到平台，则引导至平台并使其停留5s，最终时间记为逃避潜伏期时间。

1.2.4 原位杂交法检测其 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 按照试剂盒说明书进行。经切片、预杂交、杂交后使其显影放入图像分析系统Bcl-2 mRNA、Bax mRNA原位杂交图进行分析。每一切片40倍下随机5个视野，检测每一组的积分光密度、阳性细胞总面积，通过检测结果用以分析差异。积分光密度代表阳性物质的量，即测量被测个体截面积内光密度积分值。光密度越大，表示颜色越深或浓度越浓，染色的颜色深度代表了阳性物质的量越大［6］。

1.2.5 统计学方法 计量数据以“平均值±标准差”表示，采用统计软件Graphpad 8.0进行统计分析，多组间数据比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差不齐时用非参检验。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学结果 与正常组比较，模型组大鼠行动迟缓，逃避潜伏期时间明显增多（P<0.05）；与模型组相比，中药组大鼠活力增强，逃避潜伏期时间明显减少（P<0.05）。如下图1。

2.2 原位杂交法检测Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表达结果 与正常组比较，模型组大鼠Bcl-2 mRNA的表达降低（P<0.05），Bax mRNA的表达增高（P<0.05）；与模型组相比，中药组大鼠Bcl-2 mRNA的表达增强（P<0.05），Bax mRNA的表达降低（P<0.05）。如下图2、图3。

3 讨论

中医“衰老”一词最早见于《黄帝内经太素·阴阳》“若人能修道察同，去损益之病，则阴阳气和，无诸衰老，寿命无穷，与天地同极也”。同时该书亦记载“四十岁，五脏六腑十二经脉，皆大盛以平定……五十岁，肝气始衰……六十岁，心气始衰，苦忧悲，血气懈惰……七十岁，脾气虚，皮肤枯；八十岁，肺气衰，魄离，故言善误；九十岁，肾气焦，四脏经脉空虚”，详述了生长衰老的生命全过程。“尽终其天年，度百岁乃去”乃是理想状态下的自然衰老，但现实中各种因素所致的先衰的状况随处可见［7］。而五脏衰败亦可导致多种复杂疾病的发生，如脑梗死、阿尔兹海默症、帕金森病等［8］，正如《黄帝内经》言“正气存内，邪不可干”。后世医家在《黄帝内经》基础之上不断发展，认为衰老病因病机为脏腑虚衰，尤其与肺脾肾密切相关。俞才钧教授曾结合多年临床经验拟定“抗衰延年方”，取其补肺护卫、培土生金、补火生土、护阳坚阴之意，进行养生御病，延缓衰老并取得良好效果［9］。本次所使用的抗衰延年方是在俞才钧教授“抗衰延年方”的基础上加减而成，临床使用效果良好，现探索其抗衰老的机制。

现代研究表明，细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程［10］。Bcl-2被证实是最重要的有明显抑制细胞凋亡作用的基因，是1985年由Tsujimoto等在人类滤泡型B细胞淋巴瘤染色体t（14：18）易位断裂点发现的［11］，而Bax是1993年由OltvaiZN等在人和鼠的B淋巴细胞中发现的［12］。又有研究证明，Bcl-2家族中有的可以抑制凋亡（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等），有的可以促进细胞凋亡（Bax、Bak、Noxa等）。B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因是公认的长寿基因之一，大多位于线粒体外膜上，具有明显抑制细胞凋亡的作用。当Bcl-2的表达增强时，细胞的存活期则延长，抑制细胞凋亡。Bax基因是最主要的凋亡基因之一，编码的Bax蛋白质可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用［8］。同时任桂平等［13］在研究衰老过程时发现细胞凋亡起着十分关键的作用，也证实了Bcl-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax引起衰老发生的相关性［14］。

本实验研究了抗衰延年方抗衰老的可能机制。研究结果表明，与正常组比较，模型组大鼠行动迟缓，逃避潜伏期增多（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表达降低（P<0.05），Bax mRNA的表达增高（P<0.05）；与模型组相比，中药组大鼠活力增强，逃避潜伏期时间减少（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表达增强（P<0.05），Bax mRNA的表达降低（P<0.05）。最终认为，抗衰延年方可提高衰老大鼠的学习记忆能力，发挥抗衰老作用，其机制可能与其上调抑制细胞凋亡因子Bcl2表达，下调促凋亡关键因子Bax表达有关。

参考文献：

［1］国家统计局.第七次全国人口普查数据出炉［J］.中国医疗保险，2021（6）：2.

［2］许志刚，刘晓蕾，董碧蓉.衰老及衰老干预的相关研究进展［J］.现代临床医学，2023，49（6）：455-457.

［3］唐珍，易芳，郭冬梅，等.细胞凋亡对衰老的调节在肿瘤的发生发展及治疗的研究进展［J］.暨南大学学报（自然科学与医学版），2016，37（3）：215-220.

［4］靳田田，李莹，陈逸飞，等.补肾健脾开心方对D-gal诱导的亚急性衰老大鼠脑皮质炎症及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的影响［J］.时珍国医国药，2022，33（8）：1847-1849.

［5］秦红兵，杨朝晔，范忆江，等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立与评价［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（7）：1275-1278.

［6］任伟明.前癃通胶囊对大鼠增生前列腺组织中Bcl-2、Bax表达影响的研究［D］.长沙：湖南中医药大学，2015.

［7］张家玮，赵敏，卢威，等.基于“中年振基”思想探析张景岳补肾抗衰老理论和方药应用［J］.中国中医药图书情报杂志，2023，47（5）：169-172.

［8］张凯丽，陈博，田昌义，等.归芪多糖延缓大鼠脑组织衰老的作用机制［J］.食品与生物技术学报，2022，41（2）：51-57.

［9］李源清.俞才钧养生御病验方［J］.贵阳中医学院学报，1993（3）：48.

［10］陈瑶，苏波，杨群，等.D-半乳糖联合三氯化铝对C57小鼠海马Bcl2表达的影响［J］.中国老年学杂志，2017，37（16）：3909-3911.

［11］陈骢，郝健淇，彭皓宁，等.BCL-2家族凋亡调控作用及其介导的抗肿瘤药物治疗后耐药的研究进展［J］.中国胸心血管外科临床杂志，2023，30（1）：140-148.

［12］张新华，南欣荣.Bcl-2、NF-KB在腮腺腺样囊性癌中的表达及临床意义［J］.中国美容医学，2013，22（12）：1302-1306.

［13］任桂萍，衣春霖，杨永碧，等.FGF-21对D-gal诱导的小鼠肝脏氧化应激及凋亡保护机制研究［J］.东北农业大学学报，2015，46（8）：61-69.

［14］Van der Burgh R，Meeldijk J，Jongeneel L，et al.Reduced serpinB9-mediated caspase-1 inhibition can contribute toautoinflammatory disease.Oncotarget，2016，7（15）：19265-19271.

（收稿日期：2024-03-02）