文冠果组织培养再生体系的建立

摘 要：【目的】建立文冠果体细胞胚胎发生及再生植株体系，所建立的高效再生体系可为培育文冠果优良株系以及文冠果的遗传转化的基因工程奠定基础。【方法】以文冠果幼龄胚、中期胚、成熟胚为外植体，设计不同浓度生长素、细胞分裂素的正交实验，通过正交实验，确定文冠果外植体、激素浓度配比对提高愈伤组织诱导率的影响，确定文冠果愈伤组织诱导增殖、不定芽分化、伸长和生根培养最适基本培养基及其中各激素的浓度配比，建立文冠果组织培养再生体系。【结果】在1 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 的激素配比中，诱导出嫩绿色的、结构致密的愈伤组织，诱导率为80.46%，诱导愈伤组织形成的最佳品种为‘WF15’的中期胚；在1 mg/L6-BA 和0.3 mg/L IBA 的激素配比中，大量的愈伤组织出现嫩绿色的芽点，部分产生丛生芽，不定芽最高诱导率为75%；在1.0 mg/L TDZ 和0.2 mg/L IAA 的激素配比中，能促进分化出的不定芽继续良好生长，继代30 d，每个不定芽可分化3 ～ 4 个枝条，枝条高度可达5 cm，最佳品种是‘WF19’；0.3 mg/L IBA 诱导生根率最高，最高为88.35%，生成的根长约9 cm；开瓶时间为36 h 时，幼苗生长良好，移栽成活率为73.33%，显著高于其他开瓶时间【结论】诱导愈伤组织形成的最佳培养基为：MS+1 mg/L 6-BA+0.5 CmxnNWIoSYLetC0tY5BaSxTMmWPfvxOizjTIOBoxh7w=mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂；诱导不定芽形成的最佳培养基为：WPM+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂；诱导不定芽增殖分化的培养基为：MS+1.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂；诱导生根的最佳培养基为：1/2MS+0.3 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂。

关键词：文冠果；外植体；组织培养 ；再生体系

中图分类号：S668 文献标志码：A 文章编号：1003—8981（2024）02—0158—09

文冠果Xanthoceras sorbifolium Bunge， 无患子科文冠果属植物，单属单种。文冠果属落叶灌木或小乔木，耐干旱、贫瘠，抗风沙[1]，具有很强的适应性，是中国特有多用途的木本油料树种[2]，其种子含油率高[3]，籽油既可作生物柴油，又可作为食用油[4]。但是，文冠果属异花授粉植物，后代性状分离现象严重，在文冠果发展过程中，因为存在着缺乏良种、坐果率低、扦插不易生根等问题[5]，导致利用常规育种手段大量培育高产、优质、性状稳定的文冠果株系困难大，因此，急需建立高效稳定的文冠果再生体系。

植物组织器官培养是指在无菌的条件下，通过选取植物的器官或分生组织作为外植体，将其在培养基上培养，直接获得组培苗的方法。文冠果的生殖器官（种子）和营养器官（根、茎和叶）均可以作为诱导愈伤组织发生的外植体。目前，基于文冠果种胚为外植体进行组织培养的研究已经具有一定成果，顾玉红等[6] 已经将文冠果种胚接种在初代培养基上，成功获得愈伤组织。柳金凤等[7] 在文冠果细胞悬浮培养技术研究中发现NAA 对文冠果愈伤组织萌芽培养有较大的促进作用。臧国忠利用文冠果种子子叶进行实验，在MS 固体培养基上可大量产生胚性愈伤组织[8]，李晶等[9] 通过对3 个发育期果实的种胚在愈伤组织诱导方面能力的比较和分析发现，果实发育中期的种胚对诱导愈伤组织的效果最佳，但对进一步继代生根的研究还不是很充足[10-13]。上述研究表明，以种胚为外植体进行组织培养实验具有较高的可行性，然而不定芽继代以及组织培养过程中生根移栽的问题仍然没有解决，文冠果诱导、萌发、增殖和转化成苗的效率低是目前存在的最大问题。因此，仍有必要继续优化文冠果的组培快繁体系。

本研究以文冠果幼龄胚、中期胚、成熟胚为外植体，探究文冠果不同外植体、不同激素浓度配比对文冠果愈伤组织诱导增殖、不定芽分化、伸长和生根培养的影响，以建立简单高效的文冠果体细胞胚发生及再生植株体系，所建立的高效再生体系可为培育文冠果优良株系以及文冠果的工厂育苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料来源

试验材料为文冠果种子不同发育时期的种胚，均于2021 年6—7 月取自山东农业大学林学试验站（36°10′19.2″N，117°09′01.3″E），选择长势良好，无病虫害的优良株系‘WF15’‘WF19’‘46321’作为母树，取生长状况良好的幼龄胚、中期胚和成熟胚作为外植体。采果分3 个时期进行：6 月初为幼果期，果实大小接近成熟时的50%，种皮是白色柔软的，内溶物呈无色透明稠密液，结构分化还不明显；7 月初为中期，果实大小已接近成熟时的80％，种皮白色、较柔软，种胚淡黄绿色子叶和胚轴已发育完全；7 月中为果实成熟期，果皮绿色较硬，种皮也变为棕黑色、很硬。

1.1.2 材料处理

将采集到的文冠果种子用洗涤剂水漂洗，再用自来水冲洗干净。把清洗过的种子放入60 ℃的自来水中浸泡3 ～ 4 h。在超净工作台上，先用75% 的乙醇消毒2 min，无菌水冲洗3 次，每次2 ～3 min，再用50% 的次氯酸钠溶液浸泡20 min，无菌水冲洗3 次，每次2 ～ 3 min。在超净工作台上剥去种皮，取出种胚。在无菌条件下，用75% 的酒精浸泡种胚30 s，无菌水冲洗3 次，每次2 ～ 3 min。用无菌滤纸吸干表面水分备用。