猪TGF-βⅡ型受体胞外域的表达及生物活性验证

摘要：转化生长因子β1Ⅱ型受体（TGFⅡR）是TGF-β家族的主要受体。现有研究发现，TGF-β1在家畜繁殖活动中起着负调控作用，因此我们提出通过重组TGFⅡR胞外域蛋白质竞争性结合体内TGF-β1以改善家畜繁殖性能的新思路。首先，对猪TGFⅡR胞外域蛋白质编码序列进行密码子优化并进行人工合成，将合成的基因片段插入原核表达载体pET-32a（+）中。然后，将重组表达载体转入BL21（DE3）表达菌株中，并筛选合适的乳糖诱导浓度、诱导时间，以获得最高表达效率。再然后，对重组蛋白质进行纯化、复性及质谱鉴定。最后，通过体外细胞试验对重组蛋白质的生物活性进行测定。结果表明，在培养温度为37 ℃、培养时间为8 h、乳糖诱导质量浓度为2.0 g/L的条件下，可以诱导重组蛋白质的高表达，用8 mol/L尿素对包涵体蛋白质进行溶解，再以生理盐水为透析液透析24 h后，可以获得纯度达80％以上的重组猪TGFⅡR胞外域蛋白，用该重组蛋白质处理猪颗粒细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的信号分子Smad3的磷酸化水平。可以看出，本研究中表达的重组猪TGFⅡ R胞外域蛋白质具有较好的生物活性。研究结果可为进一步研究和开发有利于提高猪繁殖效率的产品奠定工作基础。

关键词：转化生长因子β1Ⅱ型受体（TGFⅡR）；原核表达；TGF-β1；生物活性

中图分类号：S828.2文献标识码：A文章编号：1000-4440（2024）07-1268-08Expression of porcine TGF-β type Ⅱ receptor in extracellular domain and validation of its biological activityZHAO Lei1，LI Hui2，QIN Shuiping3，LI Bixia2，DAI Chaohui2，ZHAO Weimin2，FU Yanfeng2，DENG Yanfei1，CHENG Jinhua2

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China；2.Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Protection and Utilization Platform of Agricultural Germplasm Resources in Jiangsu Province， Nanjing 210014， China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Huanjiang Maonan Autonomous County Dongxing Town Agricultural Technology Extension Station， Huanjiang 547117， China）

Abstract：Transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor （TGFⅡR） is the main receptor of TGF-β family. Existing studies have shown that TGF-β1 plays a negative regulatory role in livestock reproduction activities. Therefore， we proposed a new idea to improve the reproductive performance of livestock by competitively binding TGF-β1 in vivo with recombinant TGFⅡR extracellular domain protein. In order to verify it， this study first optimized the codon of porcine TGFⅡ R extracellular domain and synthesized it artificially. The synthesized gene fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET-32a（+）. Then， the recombinant expression vector was transferred into BL21（DE3） expression strain， and suitable lactose induction concentration and induction time were screened to obtain the highest expression efficiency. The recombinant protein was purified， regenerated and identified by mass spectrometry. Finally， the bioactivity of the recombinant protein was determined by in vitro cell experiment. The results showed that the high expression of recombinant protein was induced at 37 ℃， 6 h， 2.0 g/L lactose， the inclusion body protein was dissolved by 8 mol/L urea， and the recombinant porcine TGFⅡR protein with a purity of more than 80% was obtained after dialysis with normal saline for 24 h. After treatment of porcine granulosa cells with the recombinant protein， the phosphorylation level of Smad3 induced by TGF-β1 was significantly inhibited， which indicated that the recombinant porcine TGFⅡR protein expressed in this study had good biological activity. In conclusion， this study lays a foundation for further research and development of products suitable for improving the reproductive efficiency of pigs.

Key words：transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor （TGFⅡR）;prokaryotic expression;TGF-β1;biological activity

转化生长因子β1（TGF-β1）是TGF-β家族的重要成员之一[1]。在动物体内，TGF-β1可通过自分泌、旁分泌及内分泌等方式来调节细胞的增殖分化及凋亡[2-3]，因此它在维持机体正常发育和体内稳态中起着重要作用。此外，现有研究发现，TGF-β1也在调控家畜的繁殖活动中发挥重要作用。

TGF-β1调控家畜的繁殖活动可从多个方面得到体现。首先，TGF-β1可以调控类固醇激素的分泌。前人研究发现，TGF-β1浓度在卵泡液中与雌二醇浓度呈负相关，表明TGF-β1可以抑制卵泡颗粒细胞产生雌激素；体外试验也取得了类似结果，即用TGF-β1处理体外培养的颗粒细胞可显著抑制雌二醇的分泌[4]；TGF-β1还可抑制黄体细胞、孕酮合成主要相关基因的表达，并抑制孕酮合成[5]。其次，TGF-β1可通过抑制颗粒细胞黄体化及胞外基质的重构、抑制黄体血管形成等方式影响黄体发育[6-7]。再次，TGF-β1可以通过降低细胞活力、诱导促凋亡因子的表达来影响卵泡发育及颗粒细胞的增殖与凋亡[8]。最后，TGF-β1还可以通过抑制胎盘滋养层细胞的迁移和侵袭，使胚胎着床失败或流产[9-11]。综上所述，机体内TGF-β1的水平受到严格的调控，一旦失调会造成繁殖障碍。受到上述研究结果的启发，我们认为TGF-β1可能是一种抑制家畜繁殖活动的因子，并提出通过抑制TGF-β1的信号转导来改善家畜繁殖性能的新思路。

TGF-β的信号转导依赖其分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体[12]。TGF-β受体分为3种（TGFBⅠ R、TGFBⅡ R和TGFBⅢ R），其中TGF-β1Ⅱ型受体（TGFⅡR）在TGF-β1信号的接收和产生中发挥着关键作用，即TGF-β家族配体与膜上相应的Ⅱ型受体结合并诱导其磷酸化，随后募集I型受体形成复合物，并催化其激酶活性，随后I型受体招募并活化下游的Smad2/3。活化的Smad2/3与Smad4结合后形成异聚复合物并转移至细胞核内，该异聚复合物在其他辅因子的帮助下与靶基因的启动子结合而发挥转录调控作用，最终调节下游靶基因的表达[13-14]。因此，TGFⅡR是TGF-β配体的主要接收元件和信号产生元件，对TGF-β家族功能的发挥起着关键作用。

鉴于TGF-β1在家畜繁殖活动中的负调控作用，我们提出用重组TGF Ⅱ R胞外域蛋白质竞争性结合体内TGF-β1，以达到阻断或降低其信号转导的目的，最终改善家畜繁殖性能。具体而言，本研究拟用原核表达系统表达重组猪TGF Ⅱ R胞外域蛋白质，并对其进行纯化和生物活性验证，从而为进一步研究和开发适用于提高猪繁殖效率的新产品奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株、质粒及试剂原核表达载体pET-32a（+）、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）菌株购自擎科生物科技股份有限公司，质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技股份有限公司，乳糖、LB液体培养基预混粉剂、琼脂粉、氨苄青霉素（Amp）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-HCl）、尿素、咪唑、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒（分离胶含量为10％、12％、15％）、考马斯亮蓝染色液、生理盐水、ddH2O、脱色液、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、氯乙酰胺（CAA）、胰蛋白酶、肽段抽提液（ACN/formic acid）、二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、75％乙醇、DMEM/F12培养基、抗生素、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白抑制剂、蛋白质裂解液、5×蛋白质上样缓冲液、限制性内切酶Bam H I和Xho I、脱脂奶粉、一抗稀释液、加入吐温20的Tris缓冲盐溶液（TBST）、增强型化学发光试剂（ECL）发光液等均购自碧云天生物科技有限公司。

1.1.2Luria-Bertani（LB）培养基的配制按10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化钠的量称取药品并加水溶解，调节溶液的pH值至7.0，并定容至1 L，固定培养基需另加入琼脂（总含量为20 g/L），配制好培养基后高压灭菌。

1.1.3包涵体洗涤溶液、结合溶液按照50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mol/L尿素或2 mol/L尿素或3 mol/L尿素的浓度称取药品并加水溶解，调节pH值至8.0，配制包涵体洗涤缓冲液。按照20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、8 mol/L尿素的浓度称取药品并加水溶解，调节pH值至7.5，配制包涵体结合缓冲液。

1.2试验方法

1.2.1基因合成及重组表达载体的制备用在线蛋白质跨膜结构域预测工具TMHMM 2.0对从GenBank中查询的猪TGFⅡR氨基酸序列（编号： XP_020927152.1）进行预测，找出蛋白质的胞外域，并剔除信号肽序列。随后对编码胞外域的序列进行密码子优化并进行化学合成。在5′端添加Bam H I酶切位点，在3′端添加终止密码子、Xho I酶切位点，通Bam H I、Xho I将相应基因克隆至载体pET-32a（+）上，并通过质粒提取试剂盒获得重组质粒pET-32a（+）-TGFⅡR备用。

1.2.2重组蛋白质的诱导表达及SDS-PAGE检测将重组pET-32a（+）-TGFⅡR转化至BL21（DE3）菌株中，用移液枪吸取100 μL菌液，使用涂布玻璃棒将菌液均匀涂布于LB固体培养基上，于37 ℃培养过夜。待长出单菌落后，挑取单菌落接种于添加氨苄青霉素的LB液体培养基中进行过夜扩大培养。当OD600为0.6～0.8时，加入乳糖并在摇床上诱导重组猪TGFⅡR蛋白的表达，诱导用的乳糖质量浓度梯度为0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，诱导温度为37 ℃。取诱导后的菌液，用PBS重悬后超声破碎30 min，离心并收集上清液和沉淀。按照上清液∶沉淀=4∶1（体积比）加入5×蛋白质上样缓冲液，在95 ℃、10 min条件下使其充分变性，取10 μL变性溶液进行上样电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝快速染色液染色15～20 min，再用蒸馏水脱色至背景清晰。

1.2.3重组蛋白质的纯化及SDS-PAGE检测按照方法1.2.2优化的最佳诱导条件和诱导步骤进行重组猪TGFⅡR蛋白的扩大培养，将诱导好的菌液于8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入PBS重悬后，用超声波破碎仪进行破碎洗涤，参数如下：功率200 W，工作时间2 s，工作间隙2 s，共持续2 min。用超声波进行破碎处理后对液体进行离心并收集沉淀，再重复1次PBS洗涤的步骤后，分别用1 mol/L、2 mol/L、3 mol/L包涵体洗涤溶液并重悬沉淀，再用超声波破碎仪（功率200 W，工作时间2 s，工作间隙2 s，共持续2 min）进行破碎洗涤，离心并收集沉淀。重复上述步骤6次后，用8 mol/L尿素将包涵体溶解。

将重组猪TGFⅡR蛋白溶液装入处理好的透析袋中，以生理盐水作为透析液，于4 ℃透析12 h，更换1次透析液后继续透析12 h，至尿素不再渗出，确保此时重组蛋白质处于可溶解状态，表明已获得纯化的重组猪TGFⅡR蛋白溶液。

与此同时，收集每次尿素洗涤后的重悬溶液及纯化的蛋白质样品，按照4∶1（体积比）加入5×蛋白质上样缓冲液，在95 ℃、10 min条件下使其充分变性，取10 μL变性后的溶液进行电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝快速染色液染色15～20 min，再用蒸馏水脱色至背景清晰。

1.2.4质谱检测用手术刀切割电泳凝胶上的样品蛋白质条带，用玻璃棒将样品捣碎后分别加入ddH2O、脱色液、乙腈振荡5 min，离心并去除上清液。加入三（2-羧乙基）膦（TCEP）、氯乙酰胺（CAA）于60 ℃孵育30 min，进行还原烷基化反应。加入乙腈振荡5 min，随后离心去除上清液，再真空抽干。按照样品体积加入适量胰蛋白酶，于37 ℃孵育并振荡过夜进行酶切。第2 d加入肽段抽提液（ACN/formic acid），超声处理10 min，离心后取上清液，真空抽干。使用C18脱盐柱脱盐，真空抽干后于-20 ℃冻存，准备上机检测。

1.2.5重组蛋白质生物活性的检测从屠宰场收集形态正常的卵巢，依次在37 ℃生理盐水溶液、75%乙醇中清洗后抽取卵泡液，离心并收集颗粒细胞，在含有10％胎牛血清、1％三抗的F12培养基中悬浮后接种于12孔板中，再将其置于37 ℃、含5％ CO2的细胞培养箱中培养。将纯化的重组猪TGFⅡR蛋白过滤除菌后，与TGF-β1在培养箱中提前孵育4 h（使重组TGFⅡR蛋白与TGF-β1充分结合）。将猪颗粒细胞随机分为对照、TGF-β1处理组、重组猪TGFⅡR蛋白处理组，重组猪TGFⅡR蛋白与TGF-β1共孵育处理组。提前将重组蛋白与TGF-β1在37 ℃培养箱中共孵育4 h，随后对所有处理组的猪颗粒细胞同时进行加药处理，45 min后收集细胞，提取蛋白质，每孔细胞加入120 μL含1％ PMSF的胞蛋白裂解液，于冰上裂解30 min后加入5×蛋白质上样缓冲液，在95 ℃处理10 min，使其充分变性。

每组取10 μL蛋白质样品上样，经SDS-PAGE后，用半干转移法转移蛋白质至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5％脱脂奶粉于室温封闭1 h后，分别用p-Smad3、Smad3一抗于4 ℃孵育过夜，用TBST溶液洗涤后，在室温下加入与p-Smad3、Smad3一抗对应的二抗孵育1 h，再用TBST溶液洗涤，配制并吸取适量增强型化学发光试剂（ECL）覆盖于蛋白质条带上，通过化学发光成像仪（LAS-4000）进行拍摄，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参蛋白质。

2结果与分析

2.1原核表达载体的构建

GenBank中收录的猪TGFⅡR共有567个氨基酸残基，用TMHMM 2.0在线软件对TGFⅡR进行跨膜结构分析，结果发现，第1～160个氨基酸属于蛋白质的胞外域，并且第1～23个氨基酸属于信号肽部分（图1）。因此，我们选择第24～159个氨基酸进行表达研究。

通过人工化学合成法合成密码子优化后的序列，得到编码猪TGF Ⅱ R基因的胞外域蛋白质编码DNA片段。将该DNA片段经Bam H I、Xho I双酶切处理后连接至同样经过双酶切处理的pET-32a（+）载体上，经E.coli DH5α转化、筛选、扩增，最终获得用于原核表达的pET-32a（+）-TGF Ⅱ R质粒。将重组质粒用Bam H I/Xho I进行双酶切鉴定，分别得到长度为2 000 bp、5 000 bp的片段，与预期大小一致（图2），表明质粒pET-32a（+）-TGF Ⅱ R构建成功。

2.2重组蛋白质的SDS-PAGE检测

将重组表达载体转化到表达菌株BL21（DE3）中，经乳糖诱导后进行SDS-PAGE分析。考马斯亮蓝染色结果显示，以蛋白质相对分子量为10 000～180 000的Maker作为参照，可见相对分子量约为15 000的包涵体蛋白质得到成功表达（图3中的第2泳道）。分别用0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L乳糖对包涵体蛋白质进行诱导表达，结果发现，包涵体蛋白质表达效率最高的诱导质量浓度为2.0 g/L（图4中的第4泳道）。当以4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的乳糖诱导时间分别诱导蛋白质表达发现，8 h的诱导效果最佳（图5中的第10泳道）。

2.3重组猪转化生长因子β1Ⅱ型受体（TGFⅡR）蛋白胞外域的纯化和复性对分离提取的包涵体进行多次清洗后，用8 mol/L尿素将其溶解，然后对其进行复性处理，并对复性后的蛋白质进行电泳分析。重组蛋白质的考马斯亮蓝染色结果（图6）显示，泳道中出现相对分子量约为15 000的蛋白质条带，与预期相对分子量为15 000的重组猪TGFⅡR蛋白大小相符，且纯度达80％以上。由此可见，本试验获得了纯度较高且溶解度良好的重组猪TGFⅡR胞外域蛋白质。M：Marker；泳道1：纯化后的重组猪TGFⅡR蛋白。

2.4重组蛋白质的质谱鉴定结果

为了证明所表达的蛋白质是猪TGFⅡR蛋白，将上述试验中相对分子量为15 000左右的蛋白质电泳条带切下进行质谱鉴定，并对质谱鉴定试验得到的肽段序列进行BLAST比对分析。如图7所示，pET-32a（+）-TGFⅡR经乳糖诱导后表达的蛋白质确实为重组猪TGFⅡR蛋白。

2.5重组TGFⅡR胞外域蛋白质的生物活性检测

目前已知TGF-β1活性中最主要且最直观的表现是与其受体TGFⅡR结合并催化其下游信号分子Smad2、Smad3的磷酸化。因此，要鉴定本研究制备的重组猪TGFⅡR蛋白是否具有生物活性，主要是要证明其是否能与TGF-β1结合。换言之，要证明重组猪TGFⅡR蛋白是否可以与细胞表面的天然TGFⅡR竞争性结合TGF-β1，从而抑制细胞内Smad2、Smad3的磷酸化。Western blotting检测结果（图8）表明，用TGF-β1处理后，猪颗粒细胞中的Smad3磷酸化水平升高；当用重组猪TGFⅡR蛋白与TGF-β1共孵育处理猪颗粒细胞时，Smad3的磷酸化水平相较于TGF-β1单独处理显著下降。上述研究结果表明，重组猪TGFⅡR蛋白可以与TGF-β1结合，从而影响Smad3的磷酸化水平，该重组蛋白质具有生物学活性。

3讨论

TGF Ⅱ R是TGF-β家族中多个成员共用的受体，通过与TGF-β配体结合并诱导磷酸化来进行信号转导[12]。大量研究发现，TGF Ⅱ R通过影响TGF-β信号转导，从而在抑制肿瘤发生的过程中发挥关键作用。TGF Ⅱ R可以作为GA结合蛋白A （GABPA）的直接靶点而激活TGF-β信号转导，从而发挥对肿瘤的抑制作用[15]。除了抑制肿瘤，TGF Ⅱ R还在调节颗粒细胞凋亡与女性生育能力中发挥着关键作用，作为去泛素酶USP9X的新底物和间接转录靶点，参与组成包括TGF-β信号通路在内的功能性微调节网络[16]。TGF Ⅱ R对于颗粒细胞的作用在猪的研究中也有报道，Yang等[17]发现，TGF Ⅱ R是猪颗粒细胞凋亡的关键抑制因子，且TGF Ⅱ R可以作为靶点发挥作用以启动新生小鼠卵巢中的原始卵泡发育并维持原始卵泡静止[18]。很多研究发现，TGF Ⅱ R可以在不同物种中通过TGF-β信号转导从而影响卵巢颗粒细胞的凋亡。因此，阻断TGF-β信号的传导可能是一种改善母猪卵泡发育、提高繁殖效率的有效治疗手段。

然而在目前的研究中，阻断TGF-β家族的信号转导常用小分子抑制剂和siRNA干扰的方法[19]。小分子抑制剂作为一种化合物，虽然具有高效的特点，但在动物活体中使用时存在毒性较大、给药繁琐和成本较高等缺点。而siRNA干扰是目前的研究中常用的一种较为有效的方法，但是在很多时候只能进行体外细胞试验，动物活体试验也存在与小分子抑制剂类似的困难。鉴于此，结合前人研究结果，我们提出了利用重组TGF Ⅱ R蛋白竞争性结合体内TGF-β以阻断家族的信号转导的方法。目前Gao等[20]构建了人的包含抗PD-L1抗体、TGF Ⅱ R胞外域的多功能融合蛋白质，在小鼠模型中，可免疫抑制TGF-β信号转导从而抑制肿瘤的增殖。但是，目前尚未有研究发现单独重组猪TGF Ⅱ R蛋白的表达能够阻断TGF-β信号转导，并且缺乏利用重组蛋白质进行动物试验的相关研究。

因此，本研究构建了猪TGF Ⅱ R的原核表达载体，通过在大肠杆菌中进行表达后，提取并纯化重组猪TGF Ⅱ R蛋白，并对其活性进行验证。首先，在感受态细胞BL21DE3中转入原核质粒，用终质量浓度为2.0 g/L的乳糖诱导，于37 ℃培养过夜以成功表达重组猪TGF Ⅱ R包涵体蛋白。表达成功后，于冰上超声破碎细菌，离心后弃上清液，用PBS及包涵体洗涤溶液多次重悬沉淀并用超声波洗涤沉淀，随后用生理盐水对沉淀进行透析处理24 h，SDS-PAGE结果显示，蛋白质的纯化效果较好，猪TGF Ⅱ R重组蛋白质的纯度达80％以上，且处于稳定的可溶解状态。通过质谱鉴定，确定所表达的蛋白质为猪TGF Ⅱ R重组蛋白质。

与真核表达系统相比，以大肠杆菌为表达载体的原核表达系统，具有成本较低、生长速度快等特点，并可在较短时间内表达出大量目的蛋白质。本研究主要实现的是重组猪TGF Ⅱ R蛋白的包涵体蛋白质表达，虽然包涵体蛋白质需要用高浓度的尿素进行变性后复性，具有步骤复杂、可能存在影响蛋白质活性及复性率的因素等问题，但是对获得的重组猪TGF Ⅱ R蛋白在细胞水平上进行验证发现，本研究获得了具有生物活性的重组猪TGF Ⅱ R蛋白。

本研究成功表达了纯度较高、处于稳定可溶状态的猪重组TGFⅡR蛋白，并分为对照组、TGF-β1处理组、猪重组TGFⅡR蛋白与TGF-β1共孵育处理组、猪重组TGFⅡR蛋白处理组来进行猪颗粒细胞水平的验证。结果显示，猪重组TGFⅡR蛋白可以结合TGF-β1，且smad3的磷酸化水平显著下调，表明本试验用原核系统构建的猪重组TGFⅡR蛋白具有活性，可以竞争性阻断TGF-β1信号来改善母猪卵泡发育，为进一步研究和开发适用于提高母猪乃至其他家畜繁殖效率的产品奠定了工作基础。

参考文献：

[1]CHU Y L， XU Y R， YANG W X， et al. The role of FSH and TGF-β superfamily in follicle atresia[J]. Aging，2018，10（3）：305-321.

[2]LI Q Q， DU X， WANG L F， et al. TGF-β1 controls porcine granulosa cell states：a miRNA-mRNA network view[J]. Theriogenology，2021，160：50-60.

[3]GILCHRIST R B， RITTER L J， MYLLYMAA S， et al. Molecular basis of oocyte-paracrine signalling that promotes granulosa cell proliferation[J]. Journal of Cell Science，2006，119（18）：3811-3821.

[4]BAI L， CHU G Y， WANG W S， et al. BAMBI promotes porcine granulosa cell steroidogenesis involving TGF-β signaling[J]. Theriogenology，2017，100：24-31.

[5]ZHENG X F， PRICE C A， TREMBLAY Y， et al. Role of transforming growth factor-beta1 in gene expression and activity of estradiol and progesterone-generating enzymes in FSH-stimulated bovine granulosa cells[J]. Reproduction，2008，136（4）：447-457.

[6]LI H， CHANG H M， LIN Y M， et al. TGF-β1 inhibits microvascular-like formation by decreasing VCAM1 and ICAM1 via the upregulation of SNAIL in human granulosa cells[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2021，535：111395.

[7]MARONI D， DAVIS J S. TGFB1 disrupts the angiogenic potential of microvascular endothelial cells of the corpus luteum[J]. Journal of Cell Science，2011，124（14）：2501-2510.

[8]ROSAIRO D， KUYZNIEREWICZ I， FINDLAY J， et al. Transforming growth factor-beta：its role in ovarian follicle development[J]. Reproduction，2008，136（6）：799-809.

[9]POLLHEIMER J， VONDRA S， BALTAYEVA J， et al. Regulation of placental extravillous trophoblasts by the maternal uterine environment[J]. Frontiers in Immunology，2018，9：2597.

[10]ADU-GYAMFI E A， DING Y B， WANG Y X. Regulation of placentation by the transforming growth factor beta superfamily[J]. Biology of Reproduction，2020，102（1）：18-26.

[11]LI Y， YAN J H， CHANG H M， et al. Roles of TGF-β superfamily proteins in extravillous trophoblast invasion[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism，2021，32（3）：170-189.

[12]NICKEL J， TEN DIJKE P， MUELLER T D. TGF-β family co-receptor function and signaling[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2018，50（1）：12-36.

[13]LIU L， LI Q Q， YANG L， et al. SMAD4 feedback activates the canonical TGF-β family signaling pathways[J]. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（18）：10024.

[14]SHI L B， ZHOU F， ZHU H Y， et al. Transforming growth factor beta1 from endometriomas promotes fibrosis in surrounding ovarian tissues via Smad2/3 signaling[J]. Biology of Reproduction，2017，97（6）：873-882.

[15]FANG Z Q， ZHANG N， YUAN X T， et al. GABPA-activated TGFBR2 transcription inhibits aggressiveness but is epigenetically erased by oncometabolites in renal cell carcinoma[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2022，41（1）：173.

[16]YANG L， WANG S Q， PAN Z X， et al. TGFBR2 is a novel substrate and indirect transcription target of deubiquitylase USP9X in granulosa cells[J]. Journal of Cellular Physiology，2022，237（7）：2969-2979.

[17]YANG L， DU X， LIU L， et al. miR-1306 mediates the feedback regulation of the TGF-β/SMAD signaling pathway in granulosa cells[J]. Cells，2019，8（4）：298.

[18]YANG S H， WANG S， LUO A Y， et al. Expression patterns and regulatory functions of microRNAs during the initiation of primordial follicle development in the neonatal mouse Ovary1[J]. Biology of Reproduction，2013，89（5）：126.

[19]YANG M M， QIN C， TAO L L， et al. Synchronous targeted delivery of TGF-β siRNA to stromal and tumor cells elicits robust antitumor immunity against triple-negative breast cancer by comprehensively remodeling the tumor microenvironment[J]. Biomaterials，2023，301：122253.

[20]GAO Z Z， LI C， CHEN G， et al. Optimization strategies for expression of a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFBR2-ECD fusion protein[J]. Protein Expression and Purification，2022，189：105973.（责任编辑：徐艳）