铁皮石斛醇提取物对菌群失调小鼠肠道菌群的影响

摘要 为探究铁皮石斛醇提物对抗生素致肠道菌群失调小鼠肠道菌群的影响，本试验分别设置空白组和肠道菌群失调模型组（灌胃盐酸林可霉素120 mg/kg），分别给予模型组常温水、铁皮石斛醇高剂量（6 g/kg）、低剂量（1.5 g/kg）处理，观察各处理小鼠一般情况、TNF-α、IL-1水平、短链脂肪酸水平、肠道菌群组成及丰度和多样性。结果表明，铁皮石斛高、低剂量组小鼠精神一般情况好转，血清TNF-α、IL-1水平与模型组相比明显降低，短链脂肪酸水平明显提高；肠道菌群物种组成与模型组存在差异，但其丰度及多样性差异不明显。铁皮石斛醇提物对抗生素致肠道菌群失调小鼠的肠道菌群具有一定的改善作用。

关键词 铁皮石斛；肠道菌群；小鼠；菌群丰富度

中图分类号 R282；S-3" " 文献标识码 A" " 文章编号 1007-7731（2024）15-0046-05

DOI号 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.15.011

Effects of the ethanol extract of Dendrobium officinale on gut microbiota of dysbacteriosis mice

ZHU Can1" " XU Xiaoyu1" " LI Jun1" " LIU Junjie1" " GU Fangli1，2" " HUANG Renshu1，2" " HE Xiaomei1，2

（1Biological and Pharmaceutical Engineering， West Anhui University， Lu’an 237012， China; 2Anhui Province Traditional Chinese Medicine Resource Protection and Sustainable Utilization Engineering Laboratory，

Lu’an 237012， China）

Abstract To explore the effects of ethanol extract from Dendrobium officinale on the gut microbiota of antibiotic induced dysbiosis mice， a blank group and a gut microbiota dysbiosis model group（gavage of lincomycin hydrochloride 120 mg/kg）were set up， respectively. The model group was treated with normal water， high（6 g/kg）and low dose（1.5 g/kg）of ethanol extract from Dendrobium officinale， and the effects of each treatment on the general condition， TNF-α， IL-1 levels， short chain fatty acid levels， gut microbiota composition， richness， and diversity of mice were observed. The results showed that the general mental condition of mice in the high-dose and low-dose groups of Dendrobium officinale improved， and the levels of serum TNF-α and IL-1 were significantly reduced compared to the model group， while the levels of short chain fatty acids were significantly increased. There were differences in the species composition of gut microbiota compared to the model group， but no significant differences in richness and diversity. The ethanol extract of Dendrobium officinale had a certain improvement effects on the gut microbiota of antibiotic induced intestinal dysbiosis mice.

Keywords Dendrobium officinalis; gut microbiota; mice; microbial richness

抗生素具有较好的抗感染作用，其科学应用对临床医药学发展具有一定促进作用[1]。当一种或多种抗生素被大剂量长时间使用时，可能会引起肠道菌群失调，带来抗生素相关性腹泻等副作用，严重时可能导致“超级细菌”产生[2-4]。肠道菌群是寄居在人体中维持机体环境稳定与调节体内代谢的最大微生物群体。宋媛媛等[5]研究表明，长期或大量使用抗生素会抑制或杀灭机体肠道有益菌群，导致有害菌或条件致病菌大量增殖，造成肠道菌群失调。肠道菌群失调会导致食物中的多糖代谢成短链脂肪酸（Short chain fatty acid， SCFAs）减少，未经代谢的多糖滞留于肠道中从而引起渗透性腹泻。韩天雨等[6]研究发现，抗生素所致肠道菌群失调会导致多种炎症性疾病及焦虑样情绪行为。如何合理使用抗生素，在合理发挥其疗效的同时减轻或消除副作用成为临床研究的重点问题之一。治疗肠道菌群失调的途径主要有治疗原发病、合理使用微生物制剂以及粪菌移植等。林丽等[7]研究表明，短链脂肪酸在人体的生命活动中具有重要作用，其能为肠上皮细胞提供能量，促进结肠上皮细胞的增殖和分化，增强肠道免疫功能，维持肠上皮细胞的形态与功能；杨欢[8]研究指出，中草药对于恢复肠道菌群紊乱具有独特优势。

铁皮石斛中含有多糖、菲酚类、联苄、黄酮和生物碱等一系列活性成分。王治丹等[9]研究显示，铁皮石斛具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、降血压和降血糖等作用，还对修复肠道受损细胞、保护胃肠黏膜等有一定积极作用。课题组在前期研究铁皮石斛不同提取物对肠道菌群失调小鼠的影响中发现，铁皮石斛醇提物提高肠道菌群失调小鼠有益菌的比例优于多糖、水提物，但由于给药时间短，未发现醇提物对菌群失调小鼠肠道菌群丰富度及多样性的明显影响。因此，本研究拟灌胃盐酸林可霉素复制菌群失调小鼠模型，探讨延长给药时间、扩大给药剂量范围对肠道菌群失调小鼠一般情况、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白介素-1（Interleukin-1，IL-1）水平、短链脂肪酸水平、肠道菌群物种组成以及丰富度、多样性等的影响，为铁皮石斛提取物用于调节肠道菌群失调方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康清洁级昆明种小鼠40只，体重20±5 g，雌雄比例各占50%。试验动物购于安徽医科大学实验动物中心，编号：SCXK（皖）2022—001。

1.2 试验药物

铁皮石斛醇提物，铁皮石斛原料来自皖西学院石斛种植基地，取150 g粉碎过筛后，加30倍水浸泡4 h，85 ℃水煮3 h，离心后取上清液加入2倍无水乙醇，再次离心取上清液放入旋转蒸发器进行旋转蒸发浓缩，浓缩液即为铁皮石斛醇提物；盐酸林可霉素注射液购自华北制药股份有限公司。

1.3 试验试剂

TNF-α、IL-1检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；裂解液、磷酸化蛋白酶抑制剂、显影定影试剂和抗体等试剂购自赛维尔生物科技有限公司；乙醇、乙醚和磷酸等为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 试验仪器

Synergy H1多功能酶标仪（伯腾仪器有限公司）；TDL6 M台式低速低温冷冻离心机（湖南迈达仪器有限公司）；JD-801形态学图像分析系统、旋转蒸发仪等。

1.5 试验方法

对试验小鼠进行适应性饲养7 d后，分为4组，每组10只，记为空白组、模型组、铁皮石斛醇提物高剂量组和铁皮石斛醇提物低剂量组。试验第1—7天，空白组、模型组每天灌胃常温水1次，铁皮石斛醇提物高、低剂量组每天分别灌胃铁皮石斛醇提物6.0、1.5 g/kg（生药量）1次。第8—9天，模型组和铁皮石斛醇提物高、低剂量组每天灌胃2次盐酸林可霉素120 mg/kg，空白组灌胃常温水。造模结束后，空白组、模型组继续灌胃常水，铁皮石斛醇提物高、低剂量组继续按照6.0和1.5 g/kg给药至第21天。

1.6 检测指标及方法

试验期间，观察各组小鼠的精神、活动和排便状况。于给药第15天取小鼠粪便进行含水量测试，拎起小鼠尾巴，按摩其下腹部促进排便，取小鼠新鲜粪便称重后，放入105 ℃烘箱中，烘干至恒重，记录烘干后的粪便重量，并计算粪便含水量数值。于末次给药后1 h，摘眼球取血，离心，取上清液，ELISA法按试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1水平；颈椎脱臼处死小鼠，剖腹，取盲肠内容物检测短链脂肪酸水平，16S测序分析肠道菌群；对测得的有效数据进行α和β多样性分析。

1.7 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 对小鼠一般情况的影响

造模前，各组小鼠精神及活动正常；高、低剂量组小鼠摄食率较高。造模后，模型组小鼠精神不佳，活动减少，腹泻，肛门红肿；给药后，铁皮石斛醇提物高、低剂量组精神、活动有所改善，腹泻减轻，肛门红肿消失，模型组症状改善较慢。空白组、模型组、铁皮石斛醇提物高、低组小鼠粪便含水量分别为59.3%、68.3%、64.4%和64.6%；与模型组相比，给药组小鼠粪便含水量略有降低，表明铁皮石斛醇提物有助于改善模型小鼠腹泻症状。

2.2 对小鼠血清TNF-α、IL-1水平的影响

如表1所示，与空白组小鼠相比，模型组小鼠血清炎症因子TNF-α水平升高具有统计学意义（Plt;0.05），IL-1水平升高具有统计学意义（Plt;0.01），表明模型小鼠体内发生炎症。与模型组小鼠相比，铁皮石斛醇提物高、低剂量组的TNF-α、IL-1水平均有所下降，差异均存在统计学意义（Plt;0.05）。

2.3 对小鼠肠内容物短链脂肪酸水平的影响

如表2所示，与空白组小鼠相比，模型组小鼠肠内容物短链脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸水平降低，差异均存在统计学意义（Plt;0.05）；与模型组小鼠相比，铁皮石斛醇提物高、低剂量组肠内容物短链脂肪酸水平升高，差异均存在统计学意义（Plt;0.05）。

2.4 对小鼠肠道菌群的影响

2.4.1 对肠道菌群物种组成的影响" 绘制门水平的物种相对丰度堆叠柱状图如图1所示。在门水平上，各组均以拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌群，其中低剂量组Firmicutes最为丰富，模型组、高剂量组疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰富度高于低剂量组。

2.4.2 α多样性分析及曲线绘制" α多样性指数可反映个体微生物群落的丰富度和多样性。如图2A所示，各组稀释曲线在tag数达60 000时趋于平缓，说明测序数据量足够检测物种数量；如图2B所示，香浓指数曲线随着测序量的增加趋于平缓，说明测序深度足够，可以检测出样本中大部分微生物物种信息；如图2C所示，随着测序量增加，各组丰度曲线趋于平缓，曲线在横轴上的范围越大、越平缓，说明物种的组成越丰富，分布均匀度越高。综合分析可知，与模型组相比，铁皮石斛醇提物高、低剂量组菌群的丰富度及多样性未发现明显差异。

2.4.3 对肠道菌群β多样性的影响" PCoA主坐标分析通过降维方式寻找复杂样本中的主要样本差异距离，样品越相似，反映在PCoA图中的距离越近（图3），空白组与模型组、铁皮石斛醇提物高、低剂量组距离较远，铁皮石斛醇提物高、低剂量组与模型组间有一定距离，表明铁皮石斛醇提物对抗生素致菌群失调小鼠具有一定的调节作用。肠道菌群β多样性分组信息验证结果如图4所示，空白组、模型组和铁皮石斛醇提物高、低剂量组比较P=0.01lt;0.05，表明各组菌群结构差异存在统计学意义。

3 结论与讨论

肠道菌群在宿主及外部环境共同影响下建立动态生理平衡，维持宿主的正常生命活动及调节机体免疫功能。肠道菌群中的厌氧菌可发酵食物残渣中不能被消化的糖（包括抗消化淀粉、纤维素、半纤维素和果胶等）和一些寡糖，能分解部分的多肽和蛋白质产生短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸和丁酸等）[10]。杨艳青等[11]研究证明，短链脂肪酸有多种生理功能，一方面可为肠道细胞供能，促进肠道细胞生长，调节肠道中的酸碱度，减少有害菌的生长，避免肠道功能紊乱同时抑制抗炎因子的形成，从而减少肠道炎症的发生；另一方面可抑制肿瘤细胞的增殖分化，起到抗肿瘤的作用。郭春艳等[12]研究表明，肠道菌群失调可能导致短链脂肪酸生成受阻，影响肠道细胞生长，免疫力下降，进而引起肠道炎症，导致肠道功能紊乱。使用抗生素在抗病原菌的同时，可能导致肠道有益菌减少，中性菌迁移定殖，有害菌大量繁殖，引起肠道菌群失调，引发炎症性肠病，或由于肠道代谢物进入引起其他慢性肠外病变，如皮肤病[13]、肝病[14]、心血管疾病[15]和代谢性疾病[16]等。本试验结果表明，模型小鼠灌胃盐酸林可霉素后，精神活动不佳、腹泻，血清TNF-α、IL-1水平升高，短链脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸水平下降，表明盐酸林可霉素灌胃小鼠复制肠道菌群失调小鼠模型有一定效果。

调节肠道菌群可预防或缓解由肠道菌群失调引起相关疾病。张学强等[17]研究表明，干姜水提取液能明显提高抗生素相关性腹泻大鼠肠道菌群的丰度及多样性，在门水平上能提高酒精性痴呆模型大鼠厚壁菌门丰度，降低变形菌门丰度；在属水平上降低拟杆菌属、大肠杆菌-志贺菌等丰度，提高乳酸杆菌属、毛螺菌科等丰度。铁皮石斛的主要化学成分为多糖、酚类和生物碱等[18]。于子真等[19]研究发现，不同剂型的石斛可调节脾虚便秘小鼠肠道菌群；铁皮石斛还可以通过恢复肠道黏膜的完整性促进机体免疫能力的提升。铁皮石斛水提物可提高糖尿病、高血脂小鼠肠道菌群的丰度及多样性[9，20]；鲜榨铁皮石斛汁组小鼠的肠道菌群丰度提升，有益菌属丰度上升，有害菌属丰度下降[21]。

本试验应用高、低两个剂量组，研究了铁皮石斛醇提物对肠道菌群失调小鼠一般情况、血清TNF-α及IL-1水平、短链脂肪酸水平、肠道菌群组成以及丰度、多样性的影响，并分析其量效关系。结果表明，铁皮石斛醇提物可改善肠道菌群失调小鼠一般情况，降低血清TNF-α及IL-1水平，提高短链脂肪酸水平；高、低剂量组的肠道菌群物种组成和菌群结构与模型组存在差异，但丰度及多样性差异不明显。以上结果表明铁皮石斛醇提物对抗生素致肠道菌群失调小鼠的肠道菌群具有一定的改善作用，但量效关系仍需进一步验证。

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（责任编辑：李 媛）