西藏林芝蜂蜜与其他地区蜂蜜挥发性成分比较分析

曹旭珍 周志磊 欧霞 德央 张建峰 扎西措姆 毛健

摘要 ［目的］探究西藏林芝蜂蜜的特征挥发性成分。［方法］采用HS-SPME结合GC-MS对西藏林芝、陕西秦岭、西藏山南、吉林长白山和云南香格里拉地区蜂蜜的挥发性成分进行分析，并结合化学计量学研究西藏林芝蜂蜜与其他4个产地蜂蜜挥发性成分之间的差异。［结果］5个地区蜂蜜中共鉴定了103种成分，其中西藏林芝蜂蜜61种，陕西秦岭36种，西藏山南49种，吉林长白山31种，云南香格里拉42种。林芝蜂蜜挥发性成分种类最丰富，主要以酯类为主，且含量占比较大，其他4个地区则以醇类和醛类占比较大。单因素方差分析发现不同产地间有45种化合物含量存在显著差异，正交偏最小二乘判别分析进一步鉴定出水杨酸乙酯、正己酸、辛烷、苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和辛醛8种化合物是区别林芝蜂蜜和其他地区蜂蜜的关键物质，其中苯丙酸乙酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯仅在林芝蜂蜜中被检测到。［结论］酯类物质对区别林芝蜂蜜与其他地区蜂蜜具有重要意义。

关键词 西藏林芝蜂蜜；顶空固相微萃取；挥发性成分；正交偏最小二乘判别分析

中图分类号 TS 207  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）12-0177-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.037

Comparative Analysis of Volatile Components Between Nyingchi Honey from Xizang and Honey from Other Regions

CAO Xu-zhen1，2，ZHOU Zhi-lei1，2，3，OU Xia4 et al

（1.National Engineering Research Center of Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122;2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122;3.Jiangnan University （Shaoxing） Industrial Technology Research Institute，Shaoxing，Zhejiang 312000;4.Department of Tibetan Medicine，Tibet Medical University，Lhasa，Xizang 850000）

Abstract ［Objective］To explore the characteristic volatile components of honey from Nyingchi，Xizang.［Method］HS-SPME combined with GC-MS was used to analyze the volatile components of honey from Nyingchi of Xizang，Qinling of Shaanxi，Shannan of Xizang，Paektu of Jilin and Shangri La of Yunnan.In addition，the difference of volatile components between Xizang Nyingchi honey and honey from other four producing areas was studied with Chemometrics.［Result］103 ingredients were identified in honey from five regions，including 61 species of Nyingchi honey in Xizang，36 species of Qinling honey in Shaanxi，49 species of Shannan honey in Xizang，31 species of Paektu Mountain honey in Jilin，and 42 species of Shangri La honey in Yunnan.The most abundant types of volatile components in Nyingchi honey were mainly esters，which accounted for a relatively large proportion，while alcohols and aldehydes accounted for a relatively large proportion in the other four regions.Analysis of variance found that there were significant differences in the content of 45 compounds among different habitats.Orthogonal partial least squares discriminant analysis further identified ethyl salicylate，n-hexanoic acid，octane，phenylpropanoic acid ethyl ester，ethyl pentanoate，ethyl octanoate eight compounds of phenethyl alcohol and octanal were key substances to distinguish Nyingchi honey from honey from other regions.Among them，ethyl phenylpropanoic acid，ethyl pentanoate and ethyl octanoate were only detected in Nyingchi honey.［Conclusion］Esters are of great significance in distinguishing Nyingchi honey from honey from other regions.

Key words Nyingchi honey in Xizang;HS-SPME;Volatile component;Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）

基金项目 西藏藏医药大学藏医药“十四五”规划内涵建设一期项目（2021ZYYGH005）。

作者简介 曹旭珍（1999—），女，江西九江人，硕士研究生，研究方向：食品风味化学。*通信作者，讲师，硕士，从事功能食品研究。

收稿日期 2023-08-01

林芝蜂蜜是指在林芝市行政区域一定保护范围内独特的地理环境条件下，由喀尔巴阡蜜蜂、中华蜜蜂采集的符合一定质量要求的蜂蜜［1］。林芝市位于西藏自治区东南部，气候温和，雨量充沛，具有特殊的昼夜温差，孕育出各类植被及大量珍稀药材，如野黄连、野丹参、野菊花、益母草及桃树、苹果树等，喀尔巴阡蜜蜂、中华蜜蜂通过采集这些花蜜而酿造出纯天然的林芝蜂蜜。得天独厚的环境和气候条件使得林芝蜂蜜在风味上具有自然的花香味和淡淡的馨香味等特点，深受消费者喜爱。蜂蜜的风味主要与其挥发性成分有关，且主要来源于蜜蜂采集的花蜜，不同蜜源蜂蜜的挥发性成分间通常存在较大差异。

国内外学者对蜂蜜香气成分的研究开始较早，且主要集中在探求单一种类蜂蜜的特征香气成分并建立相应的指纹图谱，对于蜜源环境复杂的百花蜜挥发性成分却鲜有报道。目前已有超过600 种挥发性物质从不同蜂蜜中鉴别出来［2］，如桉树蜂蜜中最具特征的挥发性化合物是羟基酮（尤其是3-羟基-2-丁酮）［3］；柑橘类蜂蜜的特点是芳樟醇衍生物、柠檬醇和α-4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛含量较高［4］；脱氢芳樟醇是所有Erica蜂蜜的特征化合物［5］。已有学者得出林芝蜂蜜相较于西藏其他地区的蜂蜜具有更高的新鲜度和品质［6］，但对林芝蜂蜜挥发性成分的研究鲜见报道。蜂蜜挥发性成分的种类不仅取决于其蜜源种类，与挥发性成分的萃取和鉴定技术也有很大的关系［7］。研究蜂蜜常用的前处理手段已从早期的溶剂萃取［8］、超声波辅助萃取（ultrasound-assisted extraction，USE）发展到顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）［9-10］等，常用的鉴定技术包括气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、嗅闻仪（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和电子鼻等。由于HS-SPME具有操作简单、灵敏性高、需要的样品量少、成本低等优点，常与GC-MS联用用于蜂蜜和其他食品中香气成分的鉴定［11］。笔者采用HS-SPME结合GC-MS对林芝蜂蜜的挥发性成分进行解析并明确其主要风味特点，对同样产自深山的云南香格里拉、吉林长白山、陕西秦岭和西藏山南地区的蜂蜜也进行了相同的分析并与林芝蜂蜜进行对比，筛选出能鉴别出林芝蜂蜜的关键挥发性成分，为市场上打击伪劣低品质林芝蜂蜜、甄别野生高品质林芝蜂蜜提供依据，也为进一步完善林芝蜂蜜的感官特点和食用价值、推动西藏地区野生资源的开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。共收集西藏林芝蜂蜜样品18个，编号LZ1～LZ18；云南香格里拉地区蜂蜜样品6个，编号YN1～YN6；吉林长白山地区蜂蜜样品8个，编号JL1～JL8；陕西秦岭地区蜂蜜样品8个，编号QL1～QL8；西藏山南地区蜂蜜样品2个，编号SN1～SN2。所有样品均从原产地采集，样品来源地区分布如表1所示。

1.1.2 试剂。二苯甲酮、己醛、正己酸乙酯、辛醛、正己醇、壬醛、2-乙酰基呋喃、苯甲醛、芳樟醇、5-甲基糠醛、苯甲酸乙酯、茶香酮、正己酸、苯甲醇、苯乙醇、2，5-二甲酰基呋喃、辛酸、棕榈酸乙酯、癸酸、 苯丙酸乙酯、庚酸、异佛尔酮、丁二酸二乙酯、糠醛、辛酸乙酯、庚酸乙酯、正戊醇、戊酸乙酯、乙酸异戊酯，纯度＞98%，上海麦克林生化科技有限公司；C7～C30正构烷烃，色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠、乙醇，分析纯，中国国药集团化学试剂上海有限公司。

1.1.3 试验仪器。

Trace 1300气相色谱仪、ISQ 7000质量检测器，美国Thermo Fisher公司；SPME 手动进样手柄、50 μm/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（CAR/DVB/PDMS）纤维萃取头，美国 Supelco 公司；ME104电子天平，梅特勒-托利多精密仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理。

参照任佳淼等［12］的研究进行。在20 mL 的顶空瓶中加入3 g蜂蜜样品（对于固态蜂蜜先置于50 ℃水浴中加热至完全溶解，混匀后再取样）和10 μL的内标（用甲醇配制的10 μg/mL二苯甲酮溶液），加氯化钠至饱和，再置于50 ℃下磁力搅拌混匀，平衡30 min。

1.2.2 试验条件。

1.2.2.1 顶空固相微萃取（HS-SPME）条件。

将萃取头在240 ℃进样口老化至无杂峰后插入平衡好的顶空瓶中，50 ℃下吸附40 min，取出后插入GC进样口，240 ℃下解析5 min，进行GC-MS分析。

1.2.2.2 色谱条件。

色谱柱为TG-WAX MS（30 m×0.25 μm×0.25 mm）极性柱；升温程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速度升温至200 ℃，保持0 min，然后以10 ℃/min升温至240 ℃，保持5 min；载气（He）流速1.2 mL/min，不分流进样。

1.2.2.3 质谱条件。

电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；无溶剂延迟；质量扫描范围m/z 35～500。

1.2.3 定性分析。

使用2种方法定性，一是利用质谱数据库对挥发性成分进行定性分析，二是计算保留指数辅助定性，即测定相同条件下C7～C30的保留时间，再通过公式（1）计算各化合物的保留指数（RI），并与标准谱库中的进行对比，取差值相差80以内的化合物。

RI=100×n+100（t-tn）tn+1-tn（1）

式中：tn为正构烷烃Cn的保留时间；tn+1为正构烷烃Cn+1的保留时间；

t为某一化合物的保留时间，t必须在tn和tn+1之间。

1.2.4 定量分析。

对于有标样的物质建立校正曲线进行定量：配制一定浓度的标准品溶液（以乙醇作为溶剂）作为蜂蜜储备液，以40%果糖和20%葡萄糖溶液作为蜂蜜模拟液，选择9个梯度浓度对其进行稀释。HS-SPME-GC-MS的条件与样品相同，以不同浓度下色谱峰面积绘制标准曲线并代入样品峰面积计算其含量。 对于无标样的物质，采用半定量的方法，忽略响应因子，假定目标物质与内标的面积与浓度成正比进行计算。

1.3 数据分析

试验数据用Microsoft Excel进行统计分析，样品中各挥发性成分含量的平均值均由3个平行样品的相应数据计算而来；origin 2021软件绘制柱状图；SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 作为存在显著性差异的条件；SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）并计算预测变量重要性投影值 （variable importance in projection，VIP）。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜样品挥发性成分鉴定

从表2可以看出，5个产地蜂蜜共鉴定出103种香气成分，其中林芝蜂蜜鉴定出61种，陕西秦岭36种，西藏山南49种，吉林长白山31种，云南香格里拉42种，各地区挥发性成分按官能团种类分布结果如图1所示。林芝蜂蜜挥发性成分总离子流图如图2所示。从化合物的种类上看，5个地区共有的化合物有13种，分别是丁酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸烷、辛烷、辛醛、正己醇、壬醛、苯甲醛、芳樟醇、二氢芳樟醇、苯乙醇、辛酸。林芝蜂蜜挥发性成分种类最多，但从其他4个地区的蜂蜜中均鉴定出了林芝蜂蜜中没有的醚类物质和烯烃类物质。含硫化合物在林芝蜂蜜中未检出，但在山南蜂蜜中检测到。酯类物质种类数在林芝、秦岭、山南和云南蜂蜜挥发性成分中占比最大，但在吉林蜂蜜中却以醛类为主。

2，5-二甲酰基呋喃和2-乙酰基呋喃在林芝和山南蜂蜜中均检测出，其中云南蜂蜜中也检测出2-乙酰基呋喃，其余均未检出呋喃类物质。糠醛和5-羟甲基糠醛在许多蜂蜜中都被检测到［13-14］，但它们的存在一般与热处理有关，加热和不当的储存方式会使蜂蜜中挥发性成分的氨基和羰基在酸性条件下发生美拉德反应，从而生成5-羟甲基糠醛［15］，而固相微萃取离不开加热环节，所以它们对鉴别不同产地蜂蜜具有的意义不大，但可以作为评价蜂蜜新鲜度的指标［12］。辛酸在5个产地的蜂蜜中均检测到，十五烷仅在林芝蜂蜜中检测到，但粟有志等［16］对4种新疆单花蜜的挥发性成分检测中这2种物质均存在，因此可能对林芝蜂蜜的特殊香气贡献不大。在Vzquez等［3］的报道中提到的芳香化合物苯甲醛、苯乙醇、苯甲醇和苯乙醛等在此次研究中也检测到，它们普遍存在于蜂蜜及蜂蜜制品中，并且在一些单花蜂蜜中有报道过。

2.2 蜂蜜样品挥发性成分定量分析

对所有鉴定出的挥发性成分进行定量分析，单个物质含量结果如表2所示，按官能团进行分类的各类别含量结果如表3所示。由表3可知，林芝蜂蜜中挥发性成分总含量最大，为16.474 2 μg/g，其次是云南、秦岭、吉林，分别为6.138 3、5.354 4、4.831 1 μg/g，山南最小，为3.429 1μg/g。种类数最多的化合物不一定含量

占比最高，林芝蜂蜜中挥发性成分种类以酯类为主，但含量最高的化合物是2，5-二甲酰基呋喃，达到了3.414 8 μg/g。其次是醇类，含量为2.916 3 μg/g，醛类和酯类含量次之。除林芝外，其余地区蜂蜜挥发性成分中的醇类物质含量也很丰富，其中秦岭和吉林地区蜂蜜挥发性成分主要以醇类为主，含量分别高达2.538 7和1.997 9 μg/g，占其各自总挥发性成分含量的40.00%以上，秦岭蜂蜜中含量最高的化合物是二氢芳樟醇（1.295 6 μg/g），也属于醇类。陈廷廷等［17］在对4种川西高原蜂蜜的研究中也发现醇类物质含量较高，说明醇类物质可能对蜂蜜挥发性成分具有一定的贡献，同时其也可能成为区别林芝蜂蜜和其他蜂蜜的关键成分。醛类物质为云南蜂蜜的主要挥发性成分，占比37.80%，其在林芝和山南蜂蜜中含量也较高，占比在15.00%以上。酸类物质在各地区蜂蜜中含量占比也较高，同样对蜂蜜挥发性成分具有一定的贡献。

2.3 林芝蜂蜜与其他产地蜂蜜的挥发性成分差异分析

对林芝蜂蜜的61种香气成分定量结果进行单因素ANOVA分析和组间差异分析，结果表明，有45种化合物在林芝与其他4个地区蜂蜜间存在显著差异。其中乙酸乙酯、4-甲基癸烷、糖醛、乙酸异戊酯等30种化合物在此次检测中仅在林芝蜂蜜中被鉴定出来。丁酸甲酯、

壬酸甲酯、辛烷、苯乙醇和辛酸这5种化合物在林芝蜂蜜和其他产地蜂蜜中均检测到，但在林芝中的含量更大。由此可见，相较于其他4个地区的深山百花蜜，林芝蜂蜜中的挥发性成分种类更多，且多种化合物的含量高于其他产地，这可能与西藏林芝独特丰富的蜜源环境有关。

为了进一步筛选出林芝蜂蜜的代表性化合物，使用OPLS-DA对45种有显著差异的物质进行多变量统计分析。OPLS-DA作为一种有监督的多变量分析，可以有效探究引起组间差异的关键化合物。OPLS-DA分析的载荷-得分图如图3所示，林芝蜂蜜与其他4个地区的蜂蜜被有效区分开来。在OPLS-DA模型中，Q2 表示模型的预测能力，且 R2 和Q2 越接近 1.0说明模型越好，越低说明模型的拟合准确性越差，但一般情况下R2 和Q2 高于0.5则表示较好［18］。此次模型的R2X=0.934，R2=0.782，Q2=0.805，R2和Q2均大于0.5且接近1.0，表明该模型具有良好的可解释度和拟合度。又对45种有显著差异的物质进行了200次的置换检验，结果如图4所示，图4中Q2点回归线与横坐标交叉或小于0，截距为负值，统计模型有效，没有过拟合。

VIP 值可以反映风味物质对模型分类的贡献程度，将 VIP > 1 作为筛选关键风味物质的标准，各化合物的VIP值如图5所示。由图5可知，水杨酸乙酯、正己酸、辛烷、苯丙

酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和辛醛的VIP > 1，表明

这8种挥发性物质在区分林芝和其他4个地区蜂蜜起着关键作用。其中苯丙酸乙酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯是林芝蜂蜜独有的成分；苯乙醇在几个产地蜂蜜中都存在，但在林芝蜂蜜中检测到的含量最高。

3 结论

林芝蜂蜜相比其他几个产地，挥发性成分的种类更丰富，多种成分含量明显高于其他产地，尤其是酯类物质，说明林芝蜂蜜在自身挥发性成分组成上具有鲜明的特点。林芝蜂蜜挥发性成分种类以酯类、醛类和醇类为主，酯类物质是林芝蜂蜜中数量最多的挥发性物质，含量占比为12.68%。通过化学计量学筛选出水杨酸乙酯、正己酸、辛烷、苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和辛醛这8个能够区分林芝蜂蜜与其他4个地区蜂蜜的特征挥发性成分，其中有4个酯类物质，且3个酯类物质仅在林芝蜂蜜中检出。这也进一步说明酯类物质对林芝蜂蜜风味独特性具有一定的贡献。该研究为建立基于挥发性成分的林芝蜂蜜质量控制及产地鉴别提供了思路和借鉴基础。

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