TGF-β对膀胱癌组织中巨噬细胞来源肿瘤相关成纤维细胞的影响及其机制

蒲石 沈成全 胡鼎 赵新钊 秦瑞泽 刘昌学 王永华

［摘要］ 目的

探讨TGF-β对膀胱癌组织中巨噬细胞来源肿瘤相关成纤维细胞（CAF）的影响及其机制。

方法 采用Kaplan-Meier法分析膀胱癌组织中α-SMA+CD68+CAF表达水平与患者的总生存率（OS）的关系；采用免疫荧光技术检测α-SMA+CD68+CAF在膀胱癌组织中的浸润情况；采用Western blot实验检测TGF-β对α-SMA+CD68+CAF体外诱导作用。同时构建膀胱癌小鼠模型，采用免疫荧光技术和免疫组化法检测TGF-β对膀胱癌小鼠体内α-SMA+CD68+CAF的诱导作用及对CD8+T细胞浸润的影响。

结果 膀胱癌组织中α-SMA与CD68的表达呈正相关，且α-SMA+CD68+CAF高表达的患者预后更差（χ2=9.05，P<0.05）。免疫荧光技术检测结果显示，膀胱癌组织中存在α-SMA+CD68+CAF。Western blot实验检测结果显示，TGF-β可显著促进α-SMA+CD68+CAF的生成。膀胱癌小鼠模型体内实验显示，TGF-β可促进膀胱癌组织中α-SMA+CD68+CAF的生成，从而抑制CD8+T细胞的浸润。

结论 TGF-β可显著促进膀胱癌组织中巨噬细胞来源CAF的生成，从而抑制CD8+T细胞的浸润。

［关键词］ 转化生长因子β；癌相关成纤维细胞；膀胱肿瘤；肿瘤相关巨噬细胞；免疫耐受；CD8阳性T淋巴细胞；细胞浸润

［中图分类号］ R737.14    ［文献标志码］ A

随着近年来肿瘤免疫治疗的兴起，以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗中取得了良好的效果，但对于晚期膀胱癌患者存在着免疫治疗反应低及耐药等问题，限制了其在临床中的应用[1]。既往研究发现膀胱癌免疫治疗耐药的产生与免疫抑制肿瘤微环境的形成有关[2]，而肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是免疫抑制肿瘤微环境形成的重要因素之一[3]，但膀胱癌中CAF的具体来源尚不清楚。近年来在肿瘤微环境中发现了表达成纤维标志物的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）[4-6]。本课题组前期研究发现转化生长因子-β（TGF-β）、TAM、CAF与膀胱癌患者免疫治疗耐药密切相关[7-8]，由此推测TGF-β可通过诱导TAM向CAF转化，参与膀胱癌免疫治疗耐药性的产生。本研究通过体内外实验观察膀胱癌组织中TGF-β对巨噬细胞来源的CAF的影响，探讨膀胱癌中TAM向CAF转化的相关机制。

1 材料与方法

1.1 膀胱癌组织中α-SMA与CD68表达相关性及Kaplan-Meier（K-M）生存曲线分析

通过TCGA-BLCA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）收集膀胱癌患者的临床信息，以及膀胱癌组织中α-SMA与CD68 mRNA的表达水平，并通过Spearman方法分析α-SMA与CD68表达水平的相关性。根据CD68高表达膀胱癌组织中的α-SMA表达水平将患者分为高、低表达组，采用K-M法分析α-SMA+CD68+CAF表达水平与患者的总生存率（OS）的关系。

1.2 仪器与试剂

鼠源性膀胱癌细胞MB49购自武汉普诺赛生命科技有限公司。12只4周龄的C57B16/N小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。α-SMA、CD68、CD8、GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，TGF-β、重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）购自上海MedChemExpress LLC，十二烷基硫酸钠（SDS）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司，HRP偶联二抗购自美国Jackson Immuno Research公司。FITC、PE抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司。荧光显微镜购买于美国Olympus life science公司，EVOS FL Auto显微镜购买于加拿大Thermo Fisher公司。

1.3 临床样本的收集

收集2023年5月—2023年8月于青岛大学附属医院泌尿外科行全膀胱切除术的10例患者的膀胱癌组织及其正常膀胱组织，正常膀胱组织距癌灶边缘5 cm以上。随后将提取的膀胱癌组织及正常膀胱组织经脱水、石蜡包埋后制成5 μm厚的石蜡切片。患者术前均未接受过新辅助化疗、放疗或免疫治疗。

1.4 小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）向CAF的转化诱导

4周龄C57B16/N小鼠脱颈处死后，用1 mL注射器从其胫骨、股骨和髂骨骨髓腔中抽取骨髓和细胞混合液，离心后收集骨髓细胞。将骨髓细胞接种于含有10%热灭活胎牛血清（FBS）和含50 μg/L M-CSF的DMEM/F12培养基中，培养7 d后，按照相关文献报道的方法[9]，通过流式细胞术检测细胞中CD68+巨噬细胞的浓度，当超过95%的细胞为CD68+细胞时，则认为BMDM培养成功。

将BMDM细胞接种于24孔板中，分为对照组和TGF-β组，TGF-β组中每孔加入含10% FBS及5 μg/L TGF-β的DMEM培养基150 μL，对照组中每孔加入含10% FBS以及PBS的DMEM培养基150 μL，将24孔板置于37 ℃含体积分数0.05的CO2恒温培养箱中继续培养5 d，用于后续实验。

1.5 Western blot实验检测BMDM细胞中α-SMA蛋白表达量

取培养5 d后的上述两组BMDM细胞，吸出24孔板中的原培养液，每孔加入1 mmol/L SDS裂解液裂解细胞，收集细胞悬液并12 000 r/min离心30 min，分离上清液，使用BCA试剂盒检测各样本中的蛋白浓度。使用PAGE凝胶快速制备试剂盒制备SDS-PAGE凝胶，每孔上样20 μL蛋白样品后，80 V电泳30 min，120 V电泳1 h，随后290 mA转膜1.5 h。室温牛奶封闭2 h，将膜与α-SMA一抗（1∶4 000）4 ℃下孵育过夜。次日再将膜与HRP偶联二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。洗膜后用增强化学发光试剂盒显影。采用Image J软件检测各个条带的灰度值，以GAPDH（1∶10 000）为内参，计算各目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，结果取均值。

1.6 膀胱癌小鼠模型的建立

将12只C57BL/6N小鼠在25 ℃下适应性饲养7 d，取密度1×1010个/L的鼠源性膀胱癌细胞MB49细胞悬液500 μL，皮下接种于小鼠左腹股沟，将小鼠随机分为对照组与实验组，每组6只。当接种部位出现肉眼可见的肿瘤时，实验组小鼠尾静脉注射含5 μg/L TGF-β的PBS 100 μL，对照组小鼠尾静脉注射等体积PBS，两组小鼠均每2 d注射一次。饲养至第30天时麻醉后处死两组小鼠，完整剥离出肿瘤组织，置于4%甲醛中固定，依次经脱水、石蜡包埋后制成5 μm厚的石蜡切片。

1.7 免疫荧光技术检测膀胱癌患者及小鼠组织切片中的α-SMA、CD68表达

将膀胱癌患者的肿瘤组织和正常组织石蜡切片，以及小鼠肿瘤组织的石蜡切片60 ℃下烘烤2 h，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水、蒸馏水水化后，置于抗原修复液中高压煮沸20 min，并以1% ABS封闭1 h。将切片分别与稀释以后的α-SMA（1∶400）、CD68（1∶400）一抗在4 ℃下孵育过夜。次日室温下与荧光二抗孵育1 h，使用DAPI染色剂染色细胞核。最后加入抗荧光淬灭剂，甘油封片，使用Olympus荧光显微镜观察α-SMA、CD68的荧光染色情况，并用Image J软件计算α-SMA+CD68+细胞占比（每个视野下α-SMA+CD68+双阳性细胞数与总细胞数的比值）。实验重复3次，结果取均值。

1.8 免疫组化检测小鼠切片组织中α-SMA、CD8的表达

将小鼠肿瘤组织石蜡切片依次经脱蜡、水化等处理以后，置于柠檬酸钠抗原修复液（0.01 mol/L，pH 6）当中加热20 min，冷却至室温后，用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min。将切片分别与α-SMA（1∶200）、CD8（1∶10 000）一抗4 ℃下孵育过夜，第2天室温下与同种属的二抗孵育30 min，DAB显色后，用苏木素染色剂染色细胞核，脱水封片。使用EVOS FL Auto显微镜观察切片染色情况并拍照，统计每个视野下α-SMA+细胞数目与CD8+T细胞数目。实验重复3次，结果取均值。

1.9 流式细胞术检测BMDM细胞中α-SMA、CD68表达

取培养5 d的两组BMDM细胞，置于离心管中以1 000 r/min离心15 min，随后以PBS缓冲液重悬细胞，再以1 000 r/min离心15 min，弃去上清液，随后在每管中加入300 μL上样缓冲液重悬，再依次加入5 μL FITC（阳性表示α-SMA+）和10 μL PE（阳性表示CD68+）染色液。最后使用流式细胞仪分析并计算α-SMA+CD68+细胞在BMDM细胞中的占比。

2 结  果

2.1 α-SMA+CD68+与膀胱癌患者预后的相关性

对TCGA数据库相关数据分析显示，膀胱癌患者肿瘤组织中CAF标记物α-SMA和TAM标记物CD68的表达呈正相关（R=0.24，P<0.05）。K-M生存曲线分析结果显示，α-SMA+CD68+高表达组患者OS明显低于α-SMA+CD68+低表达组（χ2=9.05，P<0.05）。

2.2 α-SMA+CD68+细胞在膀胱癌患者肿瘤组织中的浸润情况

免疫荧光染色结果显示，膀胱癌患者的肿瘤组织当中存在CAF标记物α-SMA+和TAM标记物CD68+共定位表达的现象，正常组织和肿瘤组织中α-SMA+CD68+细胞占比分别为（0.33±0.18）%、（2.84±1.45）%，差异有统计学意义（t=2.971，P<0.05）。见图1。

2.3 TGF-β对α-SMA+CD68+细胞体外诱导作用

Western blot实验的检测结果显示，对照组和TGF-β组BMDM细胞中α-SMA蛋白相对表达量为分别为0.01±0.01、0.69±0.08，差异有统计学意义（t=15.41，P<0.05）。见图2。流式细胞术检测结果显示，TGF-β组中α-SMA+CD68+细胞占比明显高于对照组。见图3。

2.4 TGF-β对膀胱癌小鼠体内α-SMA+CD68+细胞的诱导作用及对CD8+T细胞浸润的影响

免疫荧光染色结果显示，对照组以及实验组小鼠肿瘤组织当中α-SMA+CD68+细胞占比分别为（1.33±1.10）%、（23.25±9.15）%，差异有统计学意义（t=4.120，P<0.05）。见图4。切片免疫组化染色结果显示，对照组和实验组小鼠肿瘤组织中每个视野下α-SMA+细胞数目分别为（10.74±5.46）、（40.93±6.87）个，差异具有统计学意义（t=8.432，P<0.05），对照组和实验组的肿瘤组织中每视野下CD8+T细胞数目分别为（61.81±11.25）、（10.07±5.54）个，差异有统计学意义（t=10.10，P<0.05）。见图5。

3 讨  论

肿瘤微环境是目前影响肿瘤治疗的主要因素之一[10]，CAF是肿瘤微环境中最丰富的基质细胞类型，具有高度异质性和多功能性[11-13]，其与肿瘤的恶性进展、侵袭转移以及不良预后密切相关[14-16]。有研究表明CAF可通过增强肿瘤微环境中细胞外基质（ECM）的硬度从而阻碍免疫细胞的浸润[17-18]。

此外CAF还可通过释放细胞因子促进血管生成以加快肿瘤的恶性进展[19]。因此，深入探索CAF的形成分化、分子分型以及其在肿瘤免疫抑制微环境形成中的作用，对于阐明膀胱癌免疫治疗耐药性的机制，克服膀胱癌免疫治疗目前面临的反应性低、耐药性等瓶颈问题具有重要意义。

本研究通过TCGA数据库分析巨噬细胞标志物CD68与成纤维细胞标志物α-SMA之间的相关性，并检测临床样本中两种标志物的表达情况，结果发现在膀胱癌组织中α-SMA表达与CD68表达存在正相关，且在膀胱癌肿瘤组织中α-SMA、CD68共定位表达现象明显高于正常膀胱组织，提示在膀胱癌肿瘤微环境中存在巨噬细胞来源的CAF细胞，即α-SMA+CD68+CAF细胞，目前已被证实肿瘤微环境中的CAF来源于多种细胞途径，如内皮间充质转化、上皮间充质转化等[20]。CHEN等[21]研究显示，TGF-β可加快肾脏纤维化的进展，而骨髓源性巨噬细胞是纤维化中成纤维细胞的主要来源[22-23]。研究发现在肺癌和神经母细胞癌中TAM与CAF水平显著相关[4]，临床上，巨噬细胞标志物的CAF也被认为是口腔鳞状细胞癌患者预后不良的指标[24]，这提示α-SMA+CD68+CAF细胞可能在肿瘤微环境中发挥重要作用，但对于α-SMA+CD68+CAF细胞的具体作用机制及相关信号通路目前尚不清楚。

为了进一步研究α-SMA+CD68+CAF细胞对肿瘤微环境的影响以及相关的信号通路，本研究通过TGF-β干预BMDM细胞的方式来尝试体外诱导α-SMA+CD68+CAF细胞生成，通过Western blot方法检测α-SMA蛋白表达水平，结果发现TGF-β干预后BMDM细胞中α-SMA蛋白的表达水平明显上调，这提示TGF-β可能在诱导α-SMA+CD68+CAF细胞生成过程中发挥作用。本研究的流式细胞术检测结果显示，TGF-β干预后α-SMA+CD68+CAF细胞数明显多于对照组。上述结果提示TGF-TGF-β/Smad3通路是骨髓源性巨噬细胞向成纤维细胞转化的重要通路[25]。TGF-β/Smad3信号传导的失调与肿瘤发生和纤维化显著相关，该通路可将成纤维细胞重编程从而导致CAF活化[26]，其主要通过调节ECM积累和CAF活化来发挥促肿瘤作用[22]。TANG等[9]通过单细胞测序研究发现，在非小细胞肺癌中，Smad3可通过TGF-β/Smad3通路促进巨噬细胞来源的CAF生成，并通过促进ECM及新生血管生成来加速肿瘤的发生发展。此外，TGF-β还可通过抑制免疫细胞的功能参与肿瘤免疫抑制微环境的形成[27]。本研究通过构建膀胱癌小鼠模型来验证TGF-β对于α-SMA+CD68+CAF细胞生成及免疫微环境的影响，通过免疫荧光技术检测小鼠肿瘤组织中α-SMA与CD68的共定位表达情况，结果发现加入TGF-β后，小鼠肿瘤组织中α-SMA+CD68+CAF细胞明显增多，这进一步说明TGF-β促进了α-SMA+CD68+CAF细胞的生成。研究显示，CAF通过分泌ECM形成物理屏障，进而阻碍免疫细胞（如T细胞）浸润，以及参与免疫抑制微环境的形成[28]，而TGF-β是促进肿瘤微环境当中CAF生成的关键信号通路[9]。本研究通过给予膀胱癌小鼠TGF-β处理并通过免疫组化检测α-SMA与CD8+T细胞染色情况，结果发现TGF-β的干预促进了小鼠肿瘤组织中α-SMA+细胞的生成，同时其还抑制了小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润，提示TGF-β可通过促进α-SMA+CD68+CAF生成，来抑制免疫细胞浸润，从而参与免疫抑制微环境的形成。

总之，本研究在膀胱癌肿瘤微环境中检测到了α-SMA+CD68+CAF细胞，并揭示了TGF-β参与免疫抑制肿瘤微环境形成的机制，可能是通过促进α-SMA+CD68+CAF的生成，进一步抑制了免疫细胞的浸润。本研究有助于进一步阐明膀胱癌免疫治疗的耐药机制，为抑制膀胱癌免疫治疗耐受提供了数据参考。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院伦理委员会的审核批准（文件号QYFYWZLL28770）。所有研究过程均遵照《赫尔辛基宣言》的规定进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学伦理委员会的审核批准（文件号20230714C571820230-905032）。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》的规定进行。

［参考文献］

[1]CRISPEN P L， KUSMARTSEV S. Mechanisms of immune evasion in bladder cancer[J]. Cancer Immunol Immunother， 2020，69（1）：3-14.

[2]MARIATHASAN S， TURLEY S J， NICKLES D， et al. TGF-β attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells[J]. Nature， 2018，554（7693）：544-548.

[3]DESBOIS M， WANG Y L. Cancer-associated fibroblasts： Key players in shaping the tumor immune microenvironment[J]. Immunol Rev， 2021，302（1）：241-258.

[4]KRAMAN M， BAMBROUGH P J， ARNOLD J N， et al. Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha[J]. Science， 2010，330（6005）：827-830.

[5]ARNOLD J N， MAGIERA L， KRAMAN M， et al. Tumoral immune suppression by macrophages expressing fibroblast activation protein-α and heme oxygenase-1[J]. Cancer Immunol Res， 2014，2（2）：121-126.

[6]MULIADITAN T， CARON J， OKESOLA M， et al. Macrophages are exploited from an innate wound healing response to facilitate cancer metastasis[J]. Nat Commun， 2018，9（1）：2951.

[7]SHEN C Q， LIU J， JIAO W， et al. A feed-forward loop based on aerobic glycolysis and TGF-β between tumor-associated macrophages and bladder cancer cells promoted malignant progression and immune escape[J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2023，149（14）：12867-12880.

[8]ZHANG Z， YU Y B， ZHANG Z L， et al. Cancer-associated fibroblasts-derived CXCL12 enhances immune escape of bladder cancer through inhibiting P62-mediated autophagic degradation of PDL1[J]. J Exp Clin Cancer Res， 2023，42（1）：316.

[9]TANG P C， CHUNG J Y， XUE V W， et al. Smad3 promotes cancer-associated fibroblasts generation via macrophage-myofibroblast transition[J]. Adv Sci， 2022，9（1）：e2101235.

[10]BINNEWIES M， ROBERTS E W， KERSTEN K， et al. Understanding the tumor immune microenvironment （TIME） for effective therapy[J]. Nat Med， 2018，24（5）：541-550.

[11]DASARI S， FANG Y M， MITRA A K. Cancer associated fibroblasts： Naughty neighbors that drive ovarian cancer progression[J]. Cancers， 2018，10（11）：406.

[12]TAO L L， HUANG G C， SONG H Z， et al. Cancer associated fibroblasts： An essential role in the tumor microenvironment[J]. Oncol Lett， 2017，14（3）：2611-2620.

[13]CHEN X M， SONG E W. Turning foes to friends： Targeting cancer-associated fibroblasts[J]. Nat Rev Drug Discov， 2019，18（2）：99-115.

[14]LAVIE D， BEN-SHMUEL A， EREZ N， et al. Cancer-asso-

ciated fibroblasts in the single-cell era[J]. Nat Cancer， 2022，3（7）：793-807.

[15]RIMAL R， DESAI P， DAWARE R， et al. Cancer-associated fibroblasts： Origin， function， imaging， and therapeutic targeting[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2022，189：114504.

[16]KILVAER T K， KHANEHKENARI M R， HELLEVIK T， et al. Cancer associated fibroblasts in stage Ⅰ-ⅢA NSCLC： Prognostic impact and their correlations with tumor molecular markers[J]. PLoS One， 2015，10（8）：e0134965.

[17]CORONA A， BLOBE G C. The role of the extracellular matrix protein TGFBI in cancer[J]. Cell Signal， 2021，84：110028.

[18]MAO X Q， XU J， WANG W， et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment： New findings and future perspectives[J]. Mol Cancer， 2021，20（1）：131.

[19]DERYUGINA E I， QUIGLEY J P. Tumor angiogenesis： MMP-mediated induction of intravasation- and metastasis-sustaining neovasculature[J]. Matrix Biol， 2015，44-46：94-112.

[20]RSNEN K， VAHERI A. Activation of fibroblasts in cancer stroma[J]. Exp Cell Res， 2010，316（17）：2713-2722.

[21]CHEN J Z， TANG Y， ZHONG Y， et al. P2Y12 inhibitor clopidogrel inhibits renal fibrosis by blocking macrophage-to-myofibroblast transition[J]. Mol Ther， 2022，30（9）：3017-3033.

[22]LEBLEU V S， TADURI G， OCONNELL J， et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis[J]. Nat Med， 2013，19（8）：1047-1053.

[23]ZHOU Y Y， LI Z L， YU S Y， et al. Iguratimod prevents renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction model mice by suppressing M2 macrophage infiltration and macrophage-myofibroblast transition[J]. Ren Fail， 2024，46（1）：2327498.

[24]ZHAO X X， DING L， LU Z Y， et al. Diminished CD68+ cancer-associated fibroblast subset induces regulatory T-cell （treg） infiltration and predicts poor prognosis of oral squamous cell carcinoma patients[J]. Am J Pathol， 2020，190（4）：886-899.

[25]SEMENZA G L. Cancer-stromal cell interactions mediated by hypoxia-inducible factors promote angiogenesis， lymphangiogenesis， and metastasis[J]. Oncogene， 2013，32（35）：4057-4063.

[26]GARRISON G， HUANG S K， OKUNISHI K， et al. Reversal of myofibroblast differentiation by prostaglandin E（2）[J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2013，48（5）：550-558.

[27]BATLLE E， MASSAGU J. Transforming growth factor-β signaling in immunity and cancer[J]. Immunity， 2019，50（4）：924-940.

[28]BIFFI G， TUVESON D A. Diversity and biology of cancer-associated fibroblasts[J]. Physiol Rev， 2021，101（1）：147-176.