樟叶总木脂素提取工艺及其抑菌活性研究

张岚雄　郑威　陈源桉　沈婧　邹双全　伍建榕　倪林

摘要：为研究樟叶总木脂素的最佳回流提取工艺及抑菌活性，以樟叶为研究对象，测定其芝麻素和9-羟基芝麻素含量，通过单因素联合Box-Behnken响应面法对樟叶总木脂素回流提取工艺进行优化，并采用带毒平板法对总木脂素的抑菌活性进行评价。结果表明，回流提取最佳工艺条件为提取温度86 ℃、料液比1∶8.39（g·mL-1）、提取时间43 min、提取溶剂为无水乙醇，在此条件下木脂素提取率达0.380 4%。各因素对提取率的影响表现为提取温度>提取时间>料液比。抑菌活性试验表明，木脂素含量为2 mg·mL-1时对链孢粘帚霉菌（Gliocladiumcatenulatum）、苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）、西瓜尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporumf）和瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）的抑菌效果最佳，抑菌率均达到50% 以上；有效中质量浓度（EC50）分别为1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1。以上研究结果为樟叶开发利用及植物源农药研究及开发提供了理论参考。

关键词：樟；木脂素；响应面法；抑菌活性；毒力

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0281

中图分类号：S792.23 文献标志码：A 文章编号：10080864（2024）05013810

樟（Cinnamomum camphora L. Presl）为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）常绿乔木植物，是我国亚热带常绿阔叶林的主要树种之一[12]，主要分布在福建、台湾、江西、广东等地区[3-5]。樟树广泛用于中医药材，樟树的根、果、枝和叶均可入药，用于治疗风湿骨痛、胃腹冷痛、腹胀、吐泻等[6]。研究表明，樟叶含有挥发性油[7]、木脂素[8]、黄酮类[9]和甾醇[10]等成分，具有抗氧化、抗炎、杀虫、抑菌等活性[11]。本课题组致力于樟树及其化合物药用价值的开发与利用研究，且前期从樟叶中分离、鉴定出木脂素类成分芝麻素和9-羟基芝麻素，其中9-羟基芝麻素是樟叶中含量最高的化合物，达0.20%，芝麻素含量也较高，可达0.02%[12]。研究表明，木脂素具有多种生物活性，如保护肝脏、抗氧化、抗病毒、抑菌等功效[13]。

已报道的樟叶木脂素回流提取工艺中存在回流次数多、回流时间长、料液比高等缺点[1415]。如何高效地从樟叶中提取木脂素成为当前亟需解决的问题，本课题组拟采用响应面法[16]优化回流提取樟叶木脂素的工艺，以含量较高的芝麻素和9-羟基芝麻素为指标，使用高效液相色谱法（highperformance liquid chromatography，HPLC）对木脂素含量进行鉴定，旨在寻求最佳提取工艺；并采用带毒平板法和菌丝生长速率法[1718]对其抑菌活性进行探讨，为樟树及其提取物的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试植物与供试病原菌

供试样品樟叶于2022年3月采自福建省泉州市南安市向阳乡海山果林场（25° 17′38″N、118°31′10″E，海拔700 m）。经福建农林大学林学院邹双全研究员鉴定为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）樟（C. camphora）。标本存放于福建农林大学自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心样品室[19]。4种供试植物病原菌[20]（表1）均由福建农林大学农药学教育部重点实验室提供，菌种保存于福建农林大学植物保护学院农药与制药工程系样品室。

1.2 试验试剂

甲醇、乙醇、乙酸乙酯为分析纯，购自中国医药集团有限公司；乙腈为色谱级，购自德国默克集团有限公司；纯水、超纯水由实验室自制；芝麻素、9-羟基芝麻素标品由实验室自制，纯度>98%；马铃薯购自永辉超市；葡萄糖、琼脂粉购自上海神尚科技公司；工业酒精购自福州艾市佳科技有限公司。

1.3 试验仪器

主要仪器包括TQ-400Y 高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）、PR224ZH/E型电子分析天平（美国OHAUS公司）、RV3V旋转蒸发仪（德国IKA公司）、HH-W600电热恒温水浴锅（济南欧莱博生物公司）、 KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、RC 2 Control冷却循环器（德国IKA公司）、Waters W2695-QDA高效液相色谱仪（美国Waters公司）、SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）、PRX-250B智能人工气候箱（宁波赛福实验仪器有限公司）、DGL-50B立式高压灭菌锅（江苏登冠医疗器械有限公司）。

1.4 樟木脂素的提取及其含量测定

1.4.1 HPLC分析条件

色谱条件参照郭茂等[21]的方法，采用Diamonsil C18 分析型反相色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm），以乙腈（A）–水（B）为流动相，梯度洗脱（0～30 min，30% A → 42% A；30～45 min，42% A → 65% A），流速1.0 mL·min-1，检测波长235 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.4.2 对照品溶液制备与标准曲线的绘制

参考郭茂等[21]的方法绘制标准曲线，分别精密称量10.8 mg芝麻素和12.3 mg 9-羟基芝麻素对照品，加入乙酸乙酯并稀释定容至5 mL，制得对照品储存溶液。量取1.0 mL对照品储存溶液混合，即得芝麻素含量为1.08 mg·mL-1、9-羟基芝麻素含量为1.23 mg·mL-1 的混合对照品溶液（H1）；各准确量取0.4 mL 对照品储存溶液混合并定容至10 mL，得到芝麻素含量为0.08 mg·mL-1、9-羟基芝麻素含量为0.08 mg·mL-1 的混合对照品溶液（H2）。将配制的混合对照品溶液H1和H2按1.4.1的条件进行检测，其中混合对照品溶液H1 分别进样1、6、10、20 μL；混合对照样品H2 分别进样2、4、6、8、10 μL，测定峰面积；以峰面积为纵坐标，分别以对照品的2 个含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.3 樟木脂素回流提取工艺

将采集的樟叶置于阴凉处风干，随后取干燥樟叶用高速多功能粉碎机进行粉碎，称取5.000 g 樟叶粉末并倒入500 mL平底烧瓶中，在不同条件下进行热回流提取，抽滤，即得到含木脂素的提取液。

1.5 单因素试验设置

以芝麻素和9-羟基芝麻素的总含量为樟木脂素总提取率的评价指标，分别考察提取溶剂、提取温度、提取时间、料液比对木脂素总提取率的影响。

1.5.1 提取溶剂对提取率的影响

称取5.000 g樟叶粉末，固定料液比1∶8（g·mL-1），提取时间40 min，提取温度90 ℃，将提取溶剂分别设置为甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯，按照1.4 的方法进行测定。

1.5.2 提取温度对提取率的影响

称取5 g樟叶粉末固定料液比1∶8（g·mL-1），提取时间40 min，提取溶剂为无水乙醇，分别设置提取温度为80、85、90、95、100 ℃，按照1.4的方法进行测定。

1.5.3 料液比对提取率的影响

称取5 g樟叶粉末固定提取时间40 min，提取温度90℃，提取溶剂为无水乙醇，将料液比分别设置为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g·mL-1），按照1.4的方法进行测定。

1.5.4 提取时间对提取率的影响

称取5 g樟叶粉末固定料液比1∶8（g·mL-1），提取温度90℃，提取溶剂无水乙醇，提取时间分别为20、30、40、50、60 min，按照1.4的方法进行测定。

1.6 Box-Behnken 响应面设计

根据单因素试验得出提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）3个因素的水平值（表2），使用Design Expert 软件进行Box-Behnken 响应面设计及数据分析，共设计17 组试验，中心点试验重复5次。

1.7 樟叶提取物抑菌试验

以樟叶中提取出的木脂素为研究对象，采用带毒平板法及菌丝生长速率法对西瓜尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporumf）、链孢粘帚霉菌（Gliocladiumcatenulatum）、苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali Miyabeet Yamada）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）4种供试植物病原菌进行抑菌活性研究。用乙酸乙酯对樟木脂素进行溶解，药液最终质量浓度为2.0 mg·mL-1，以相同溶解条件的溶液作为空白对照，测定抑菌活性。当抑制率≥50%时，将木脂素配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·mL-1 的含药PDA培养基，接种4种植物病原菌培养后再次测定其抑菌活性，并计算毒力回归方程、有效中浓度（EC50）和相关系数（r），每处理组3次重复。菌丝生长抑制率（%）的计算公式如下。

抑菌率=[（D1-D2）/（D1-0.5）]×100% （1）

式中，D1 为对照菌落直径，D2 为处理菌落直径。

1.8 数据处理与分析

运用Excel 2016及SPSS 26对试验数据进行统计分析，采用Design Expert 8.0.6进行响应面分析，使用Orign 9.8.5.204对图表进行处理。

2 结果与分析

2.1 HPLC 检测结果

混合对照品与样品的色谱图如图1 所示。9-羟基芝麻素和芝麻素在检测波长235 nm处能实现分离，二者分离度均高于1.5，保留时间分别为30.769和43.740 min。

2.2 标准曲线

樟叶中芝麻素和9-羟基芝麻素的标准曲线如图2所示。芝麻素和9-羟基芝麻素的标准曲线的线性回归方程如下所示。

y=2×109x+8 316.5，R2=0.999 7 （2）

y=2×109x+144 585.0，R2=0.999 6 （3）

2.3 单因素试验分析

不同因素下的木脂素提取率如图3所示。提取溶剂为无水乙醇时，木脂素的提取率极显著高于乙酸乙酯，显著高于甲醇，故选择无水乙醇为最优提取溶剂。

木脂素提取率随提取温度的提高先升高后降低。当提取温度为85 ℃时，樟木脂素提取率最高，极显著高于90、95和100 ℃（P<0.01），显著高于80 ℃（P<0.05）。因此选择85 ℃作为响应面分析中提取温度的中心点。

木脂素的提取率随料液比的减小先升高后降低，在1∶8（g·mL-1）时最大。当料液比为1∶8（g·mL-1）时，木脂素的提取率极显著高于料液比1∶10（g·mL-1）（P<0.01），显著高于料液比1∶4（g·mL-1）（P<0.05），与料液比1∶6（g·mL-1）差异不显著（P>0.05）。根据上述结果，选择1∶8（g·mL-1）作为响应面分析中料液比的中心点。

木脂素的提取率随提取时间的延长呈先升高后降低趋势，当提取时间为40 min时，木脂素的提取率最高，极显著高于20、50和60 min（P<0.01），显著高于30 min（P<0.05），故选择40 min为最优提取时间。

2.4 响应面分析

2.4.1 响应面回归模型建立与方差分析

依据响应面试验结果（表3），通过Design-Expert 8.0.6软件二次多项式回归拟合，得到木脂素提取率（Y）与提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）3个因素的三元二次多项次回归方程，如下所示。

Y=3.791×10-3+3.985×10-5A+2.633×10-5B+3.692×10-5C+2.608×10-5AB-9.972×10-6AC-1.126×10-5BC-9.758×10-5A2-7.222×10-5B2-5.103×10-5C2 （2）

对该回归模型进行方差分析（表4）可知，该回归模型达到极显著水平（P<0.000 1），决定系数（R2）为0.985 5，失拟项不显著（P=0.309 2），说明该模型与试验数据拟合程度较高。

在回归模型中，一次项A、B、C 均达到极显著水平（P<0.01），表明影响樟木脂素提取率的因素依次为提取温度、提取时间、料液比；二次项A2、B2、C2也均达到极显著水平（P<0.01）；A 和B 交互作用达显著水平（P<0.05），A 和C 及B 和C 的交互作用不显著（P>0.05）。由此表明，3个因素对樟木脂素提取率的影响较为复杂，为非线性关系。

2.4.2 等高线图与响应曲面分析

由图4可知，提取温度与料液比的交互作用显著影响樟木脂素提取率（P<0.05），主要表现为当提取温度逐渐升高时，提取率先逐渐增大后趋于平缓；当料液比逐渐增加时，提取率呈现先增大后减小的趋势；当提取温度为86 ℃、料液比1∶8.39（g·mL-1）时，木脂素提取率最大。提取温度和提取时间的交互作用对木脂素提取率影响不显著，当提取温度为86 ℃、提取时间为43 min时，提取率达到最大；由等高线图可知，相较于提取时间，提取温度对木脂素提取率的影响更为显著。料液比和提取时间的交互作用对木脂素提取率影响不显著，当料液比为1∶8.39（g·mL-1）、提取时间为43 min时，提取率最大；由等高线图可知，相比于料液比，提取时间对木脂素提取率的影响更为显著。

2.5 验证试验分析

通过响应面分析得到樟叶木脂素回流提取的最佳工艺条件：提取温度86℃、料液比1∶8.39（g·mL-1），提取时间43 min，该条件下木脂素提取率的预测值为0.380 4%。为验证响应面法所得结果的可靠性，在以上工艺条件下进行3次试验，结果（表5）表明，木脂素的平均提取率为0.380 5%，与预测值接近，且符合正态分布，两者的相对误差为0.015 6%，表明响应面建立的回归模型与验证试验结果拟合程度较高，能较好地预测樟叶木脂素的提取情况。

2.6 樟提取物抑菌活性

由图5可知，当樟叶木脂素含量为2 mg·mL-1时，对4种供试植物病原菌均有良好的抑菌效果，抑菌率均达到50%以上。对4种供试植物病原菌毒力进行测定，结果如图6和表5所示，随着剂量的增加，对这4种病原菌的抑菌效果也越来越明显，EC50分别为1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1。

3 讨论

在工业生产中樟常用于精油提取，但精油提取率较低。为丰富樟树的多样化利用，本研究利用Box-Behnken响应面法优化樟叶木脂素回流提取工艺，优化后的最佳回流提取工艺为提取温度86 ℃，料液比1∶8.39（g·mL-1），提取时间43 min，提取溶剂为无水乙醇，此时木脂素提取率为0.380 4%。与周海旭等[22]、袁列江等[23]优化的工艺条件相比，回流次数减少，时间大幅度缩短，由2 h缩短至43 min，料液比从1∶11（g·mL-1）减少至1∶8.39（g·mL-1），得到的木脂素提取率与传统提取率（0.392 1%）相近。与紫外分光光度法进行樟叶木脂素含量测定不同，本研究以含量较高的芝麻素和9-羟基芝麻素为指标，并采用HPLC对总木脂素含量进行测定，HPLC具有灵敏度高、分析速度快等特点[2425]，得到的结果准确性更高、专属性更强、重复性更好。同时，本研究还研究了樟叶木脂素对4种常见植物致病真菌的抑菌率，发现其对链孢粘帚霉病菌、苹果黑腐皮壳病菌、西瓜尖孢镰孢菌和瓜果腐霉菌这4种病原菌均有较好的抑菌效果，抑菌均达到50%以上；毒力测定表明其对4种病原菌的有效中浓度（EC50）分别为1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1，为后续樟叶开发利用及植物源农药研究及开发提供了一定的理论参考。

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（责任编辑：张冬玲）

基金项目：福建省林业科技研究项目（No.2023FKJ28）；福建省科技计划项目（2023N0003）。