玫瑰秸秆与牲畜粪污厌氧消化特性及微生物群落研究

张昱　张洪波　张瑜瑜　陈丽娟　赵明方　夏云

摘要：为了解玫瑰秸秆与猪、牛粪污在不同总固体（total solid，TS）含量厌氧消化中理化性质与微生物群落的动态变化，在常温条件下设置3种TS含量（3%、5%、7%）处理，对产甲烷量及厌氧消化系统的效率和稳定性进行分析，并结合定量荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）对关键微生物类群进行测定。结果表明，3%TS处理产甲烷量最高且延滞期短（20 d），以挥发性固体（volatile solid，VS）计，75 d累计产甲烷量262.80 mL·g-1 VS，比5%TS、7%TS处理分别高16.14%和23.86%。挥发性脂肪酸（volatile fatty acids， VFAs）在3种TS处理中均表现出先上升后降低的趋势。对厌氧消化系统中微生物菌群的分析表明，在3种TS处理下古菌群落中的甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）均为正常产气阶段（30～75 d）目水平下优势菌群，其中5%TS处理试验结束时最高丰度为77.46%；而细菌群落中脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）为目水平下优势菌群，在75 d时，脱硫弧菌目的细菌丰度在3%TS、5%TS处理下相较于开始时（0 d）分别下降8.36%和1.24%，而7%TS处理上升1.68%。综上所述，3%TS处理为最优条件，具有最大产气量和最短的延滞期，微生物菌群的组成相对稳定高效，3%TS处理的厌氧消化系统可以有效地提高玫瑰秸秆厌氧消化性能。

关键词：厌氧消化；玫瑰秸秆；总固体含量；荧光原位杂交；微生物群落

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0740

中图分类号：S39 文献标志码：A 文章编号：10080864（2024）05020111

中国是玫瑰生产大国，玫瑰在全国各地均有栽培。然而，种植玫瑰无论是食用或是提取精油等都只是针对于玫瑰花瓣的利用过程，而对废弃玫瑰秸秆的处理和利用鲜有报道[1]。玫瑰秸秆含有大量的有机质，焚烧或作为垃圾处理会造成环境污染，也是对废弃玫瑰秸秆资源化的极大浪费。以全国最大的鲜切花交易市场——云南昆明斗南花卉市场为例，每天可产生20～30 t 玫瑰秸秆垃圾[23]，大量的玫瑰秸秆在花卉市场堆积和垃圾化处理将会对周边环境造成巨大负担[4]。

当今世界正在对替代能源进行深入研究[5]。厌氧消化从农业秸秆和动物粪便中生产沼气已被视为一种环保且可持续获取能源的方式，通过这种方式，农业废弃物被转化为清洁、易于使用的高能量燃料（甲烷）[6]。厌氧工艺的优点是废弃物处理过程相对稳定，废弃物污泥产量少，减少了病原体污染，并且可以生产沼气作为有用的最终产物[7]。

目前，对于玫瑰秸秆进行厌氧消化的研究主要是对于厌氧工艺的提升和改进。赵霞[1]针对不同的起始pH、温度、接种物配比及农药氧化乐果含量进行研究发现，起始pH为7、消化温度35 ℃、猪粪与玫瑰秸秆质量比为3∶1、氧化乐果含量在0～90 mg·L-1为最佳工艺条件。司祥[8]利用NaOH对玫瑰秸秆进行预处理，当玫瑰秸秆与猪、牛粪混合物的质量比为1∶3时，累计产气量最高。李梦洁[9]利用半连续发酵对厌氧消化体系中的接种量和原料总固体（total solid，TS）含量进行研究，得出最佳接种量为40%，最佳原料TS含量为20%。关于在玫瑰秸秆厌氧消化过程中微生物如何参与改变环境并且持续稳定产出甲烷的研究鲜有报道。本研究通过设置3种不同的TS（猪、牛粪混及玫瑰秸秆的混合物）含量进行厌氧消化处理，分析其理化性质及甲烷产量，最后利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）监测微生物群落中古菌和细菌群落的变化，研究混合猪、牛粪对玫瑰秸秆进行厌氧消化处理的过程，以期为提高处理效率和改进工艺流程提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

接种物试验材料为云南省昆明市昆明学院白沙河牲畜饲养基地的猪粪和牛粪的混合物，接种物在正式试验前进行常温驯化30 d，利用2层纱布过滤大颗粒杂质后装填入反应器。玫瑰秸秆采集于昆明市斗南花卉市场。玫瑰秸秆剪为1 cm大小。试验材料与接种物性质如表1所示。

1.2 试验装置

本试验采用批量发酵试验，即在每个厌氧发酵反应器中一次性投入接种物和原材料，猪粪牛粪混合物（猪粪与牛粪TS配比为1∶1）与玫瑰秸秆的TS之比为1∶1。试验装置如图1所示，主要由反应器，集气瓶与量筒构成。

1.3 试验设计

本试验为重复试验，即在1 L厌氧瓶中装入700 g有效发酵物质。接种物与原料装入厌氧瓶中后充入氮气5 min，保证充分的厌氧环境。根据TS含量设置3%（3%TS）、5%（5%TS）、7%（7%TS）3个处理， 其中TS含量中接种物与玫瑰秸秆的TS配比为1∶1，每个处理3次重复。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 理化性质测定

总固体（TS）含量采用烘干法测定，挥发性固体（volatile solid，VS）含量采用马弗炉灼烧法测定[10]；采用van Soest 等[11]的方法测定纤维素、半纤维素、木质素；产气量利用排水法进行收集并测量体积[7]；挥发性脂肪酸（volatile fatty acids， VFAs）含量采用蒸馏滴定法[12]进行测定，以乙酸分子质量作为基数计算。氨氮（ammonia nitrogen，AN）依据纳氏试剂分光光度法[13]测定；化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）采用重铬酸钾快速消解分光光度法[14]测定；总有机碳含量测定采用重铬酸钾外加热法，总氮含量测定采用凯氏定氮法[12]；pH使用pH计测定。甲烷含量利用GC1102气相色谱仪测定，每隔5 d测定1 次甲烷含量。色谱条件：进样口温度110 ℃，热导检测器温度120 ℃，取样量0.4 mL，保留时间7 min，载气为H2，根据甲烷含量和产气量相乘计算得到累计甲烷产量。发酵料液含量依据以下公式进行计算。

式中，M0为料液含量，%；Xi为i 物料的质量，g；Mi为i 物料的总固体（TS）含量，g；W 为所需增加水量，g。

1.4.2 微生物群落测定

利用FISH技术对古菌和细菌的微生物菌群进行分析测定，所有FISH分析方法均参照Xia等[15]和Kong等[16]的方法稍作修改。首先，从厌氧发酵反应器中取出污泥样品，立即使用4% 多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）和50%的乙醇在冰上固定4 h。然后，固定样品在1∶1的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）和乙醇溶液中洗涤，并储存在-20 ℃冰箱中备用。研究中使用的16S rRNA靶向寡核苷酸探针序列基于probebase[17]，如表3所示。在FISH试验过程中，载玻片上的固定样品在50%、80% 和96% 乙醇溶液中分别脱水3 min，并在37 ℃下用CARD FISH处理以增加16S rRNA 基因探针的穿透性[25]。在46 ℃条件下使用8 μL杂化液杂化3 h，在48 ℃下使用洗脱液洗脱15 min，随后在室温下下用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液（300 μg·mL-1） 染色10 min。使用荧光显微镜进行观察，从每个样品中随机捕获30幅显微视野的图像，所有图像均使用Image J软件处理，基于对荧光信号的像素分析，每个背景的最高强度被确定为阈值，强度高于该阈值的像素为探针杂交微生物占据的区域。总古菌的丰度由ARC915探针染亮的古菌面积确定，总细菌丰度由DAPI 染亮的微生物面积确定。显微镜视野中不同种群的相对丰度由目标微生物染亮的面积除以总古菌或总细菌所染亮的面积确定。不同古菌种群丰度和不同细菌种群丰度计算公式如下。

式中，PA 为不同靶标古菌群落的相对丰度；MA 为ARC915 探针染亮的荧光面积；MD 为DAPI染亮的荧光面积；PB为不同靶标细菌群落的相对丰度。

1.5 数据分析

常规作图采用Origin 2022b和Adobe Illustrator2020 软件，常规数据分析采用Excel 365 和IBMSPSS 22 软件。微生物差异性分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA） 方法。冗余分析（redundancy analysis，RDA）采用R 4.1.3 中的vegan包，作图采用ggplot2和ggrepel包。

2 结果与分析

2.1 累计产甲烷量与甲烷含量分析

由图2可知，在3种不同TS含量处理下，75 d时累计产甲烷量存在较大差别，3%TS处理累计产甲烷量最高（以VS计算），达262.80 mL·g-1 VS，相比于5%TS 处理的204.07 mg·L-1 VS 和7%TS 处理的175.38 mg·L-1 VS分别高16.14%和23.86%。试验开始20 d后，3%TS处理累计产气量相比于其他处理呈明显上升趋势，说明在较低的TS含量下有利于甲烷的产生，且厌氧消化的延滞期更短。对甲烷含量的测定表明，3 种TS 处理在试验前期（3%TS处理1～20 d，5%TS处理1～25 d，5%TS处理1～40 d）的甲烷含量均受到不同程度的抑制，后期3种处理基本维持在一个稳定的区间，其中3%TS处理稳定区间时间段为20～75 d，5%TS 处理为30～75 d，7%TS处理为40～75 d。以上结果表明，3%TS处理的产甲烷效率最高。

2.2 厌氧消化反应器VFAs、COD、AN 和pH 变化分析

由图3可知，各处理VFAs含量均呈先升高后降低的变化趋势，起始（1 d）时VFAs含量7%TS处理最高，为5 953.46 mg·L-1；3%TS处理最低，仅为1 708.77 mg·L-1。3种处理VFAs含量达到峰值的时间也不同，3%TS处理的VFAs含量在第15 天时达到峰值，为4 537.94 mg·L-1；5%TS处理的VFAs含量在20 d 时达到峰值，为7 021.03 mg·L-1；7%TS 处理的VFAs 含量在25 d 时达到峰值，为9 917.92 mg·L-1。各处理达到峰值后VFAs含量均表现为逐步下降直至结束，75 d时3%TS、5%TS、7%TS 处理VFAs 含量分别为1 924.10、296.21、4 408.41 mg·L-1；与最高峰值相比，各处理最终消耗VFAs的占比分别为57.60%、53.05%、55.55%。

COD的变化趋势与VFAs类似，3种处理均表现为先升高后降低的趋势。3%TS、5%TS、7%TS处理COD 起始含量分别为5 566.37、14 233.03、28 599.70 mg·L-1； 3 个处理COD 含量均在第15天达到峰值，分别为14 366.37、21 099.70、30 533.03 mg·L-1；峰值至试验结束时COD去除率分别为83.30%、78.67%、61.95%。各处理对物料的利用情况良好，其中，3%TS处理的COD去除率最高。

3%TS、5%TS、7%TS 3种处理的AN含量波动不大，基本维持在稳定的范围内。其中，3%TS处理的波动范围在38.57～95.77 mg·L-1，5%TS 处理在72.86～148.49 mg·L-1，7%TS 处理在116.86～196.94 mg·L-1。

各处理的pH在试验前期均出现明显下降的趋势。7%TS处理的下降幅度较大，在第15天时pH从开始的7.0下降到5.3，已经出现酸化现象；25 d 后逐步恢复，直至试验结束时pH 约为7.0。3%TS、5%TS处理pH同样出现明显下降的趋势，但趋势相对缓和，至试验结束时pH分别约为7.4和7.1，均略高于初始值7.0。

2.3 古菌群落相对丰度分析

利用FISH技术对厌氧消化反应器中不同TS处理的古菌和细菌群落进行了分析发现，在不同时间段不同处理之间古菌和细菌丰度存在明显差异（图4）。对古菌群落的分析表明，厌氧消化反应器中包括氢营养型的甲烷杆菌目（Methanobacteriales）和甲烷球菌科（Methanococcaceae）、乙酸营养型的甲烷鬃毛菌属（Methanosaeta spp.）和兼性营养型甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）。甲烷杆菌目作为一类氢营养型甲烷菌，在试验前（0 d）处于较高的丰度（21.05%），5%TS、7%TS处理均在第15天达到峰值，相对丰度分别为25.22% 和31.85%，3%TS处理在第15天时相对丰度较试验开始时下降9.79个百分点。试验前期（15 d）甲烷杆菌目是7%TS处理产甲烷菌的优势菌群，15 d后3种TS处理中甲烷杆菌目的相对丰度均迅速下降直至结束，在15～75 d，3%TS 处理从11.56% 下降至7.88%，5%TS处理从25.22% 下降至2.76%，7%TS处理从31.85%下降至4.84%，相对丰度平均减少11.73～13.40个百分点。

甲烷鬃毛菌属为典型的乙酸营养型甲烷菌，不同TS处理的甲烷鬃毛菌属相对丰度变化趋势与甲烷杆菌目类似。3%TS处理下降幅度较大，试验开始（0 d）时相对丰度为21.05%，结束（75 d）时为7.82%，相较于试验开始时相对丰度下降13.23个百分点；5%TS处理从0 d的25.05%下降至75 d时的13.45%，7%TS 处理从0 d 时的25.05% 下降至75 d时的13.16%，2个处理相对丰度平均减少11个百分点左右。

同样作为氢营养型甲烷菌的甲烷球菌科，除7%TS处理出现相对丰度明显上升趋势外，另外2个处理均维持在较低水平，变化不大。甲烷八叠球菌目作为一类兼有乙酸、氢和甲基营养型的甲烷菌，3种TS处理在试验前期（0～15 d）均表现为较低的丰度，在15 d时，3%、5%、7%TS处理的相对丰度分别为12.73%、16.84% 和10.15%；在15～30 d时，3种处理的甲烷八叠球菌目相对丰度均出现明显的上升过程，其中，3%TS处理上升幅度最大，从15 d时的12.73%上升至30 d时的30.05%，相对丰度增加17.32个百分点。试验中期至结束（30～75 d），3种TS处理中甲烷八叠球菌目均为优势菌群，其中，5%TS处理在试验结束时甲烷八叠球菌目相对丰度最高，为77.46%。

2.4 细菌微生物群落相对丰度分析

细菌群落中微生物相对丰度随不同处理TS含量和时间的变化存在差异（表4）。在75 d时，3个处理中放线菌门（Actinobacteria）相对丰度比试验开始时（0 d）有明显提高，且放线菌门在不同处理中也存在显著差异，7%TS 处理显著高于3%TS处理。厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌种，在3种处理中在试验全程均维持在相对较高的水平，平均相对丰度在38.51%～40.14%。拟杆菌目（Bacteroidales）在不同处理中均大幅提高，与0 d时相比，75 d 时提高9.76～11.50 个百分点。75 d时，变形菌门下的β-变形菌纲、γ-变形菌纲的相对丰度在7%TS处理中均显著高于3%TS处理。纤维杆菌属（Fibrobacter）相对丰度在中高TS含量下较高（表4，图5），整个试验过程中，与其他TS处理相比纤维杆菌属在7%TS处理中始终处于较高的丰度，试验后期略有下降。脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）在3 种处理中的相对丰度变化存在差异（表4，图5），3%、5%TS处理中脱硫弧菌目相对丰度呈逐步下降趋势，3%TS处理从15 d时的15.03%下降至75 d时的3.29%，5%TS处理从30 d时的15.25%下降至75 d时的10.41%，而7%TS处理在试验全程维持在相对较高的水平，相对丰度范围在13.33%～19.35%。与初始值相比，脱硫弧菌目在3%TS、5%TS处理中相对丰度分别降低了8.36 和1.24 个百分点，而7%TS 处理升高了1.68个百分点。

2.5 关键微生物群落与理化因子冗余分析

在分析微生物群落与环境因子的相互作用之前，利用降趋势对应分析（detrendedcorrespondence analysis，DCA）分析对数据进行判断，基于DCA分析得出最大轴长为0.33，小于3，本试验数据适合冗余分析（RDA）。RDA 分析结果表明（图6），总方差解释率为88.34%，其中RDA1 的解释率为68.59%，RDA2 的解释率为13.96%，两轴累计方差解释率为80.21%，RDA排序结果较为可靠。甲烷含量和pH、甲烷杆菌目、甲烷鬃毛菌属存在负相关关系，与甲烷八叠球菌目存在正相关关系。COD、VFAs、AN与甲烷球菌科、纤维杆菌属、甲烷鬃毛菌属存在正相关关系，与甲烷八叠球菌目存在负相关关系。

3 讨论

将玫瑰秸秆作为厌氧消化材料，既能解决农业环境污染，又能带来经济效应。猪粪与牛粪进行混合作为厌氧消化原料进行消化反应，一方面猪粪中具有高效的蛋白质分解细菌，另一方面牛粪中瘤胃微生物菌群可以促进纤维素的降解。

TS含量是影响玫瑰秸秆产甲烷的重要因素之一。高TS含量中水含量较少，限制了物质的交换；过低的TS含量同样也会造成甲烷产量减少，反应器内的原料无法供应充足的营养物质，会导致容积产气率低，且需水量和沼液排放量大[26]。因此，寻找合适的TS含量对于提升厌氧消化效率至关重要。Wang等[27]研究不同TS含量下玉米秸秆的厌氧消化产气性能发现，产甲烷量有明显的差异，当TS含量在8%～13%时，甲烷产量逐步提高，TS含量大于14%，甲烷产量急剧下降，这与本研究结果一致，当TS含量大于3%时，甲烷产量逐步下降，3%TS处理比另外2种处理的甲烷产量分别提高16.14%、23.86%，表明玫瑰秸秆较适合在低TS含量下进行厌氧消化。

高TS含量厌氧消化试验同样会造成VFAs积累，并抑制甲烷产量。Abbassi-Guendouz等[28]利用废弃纸板进行厌氧消化试验发现，当TS含量升高VFAs 含量随之升高，而TS 含量超过30% 时，VFAs 有明显的积累现象，当TS 含量达到30%～35%时，VFAs含量升高到29 000～36 000 mg·L-1。本试验得出了类似的结果，TS 含量升高导致了VFAs的积累，特别是试验前期在3种处理下均产生了不同程度的VFAs 积累现象。3%TS 处理下的VFAs积累程度较轻，15 d后开始下降，原因可能是玫瑰秸秆在厌氧消化前期降解了易消化的大分子从而释放出大量的VFAs。

利用FISH技术对古菌和细菌的微生物群落分析表明，古菌群落中产甲烷菌群从前期氢营养型甲烷杆菌目和乙酸营养型甲烷鬃毛菌属相互竞争，至后期兼性营养型的甲烷八叠球菌目成为优势菌群。古菌中产甲烷菌的相对丰度分析表明，乙酸营养型、氢营养型和兼性营养型的甲烷菌在反应体系中相对丰度存在明显的竞争现象。试验前期高水平VFAs和COD以及低水平AN可能导致其他类型产甲烷菌（单一氢或乙酸营养型）受抑制程度明显，而甲烷八叠球菌目可利用底物类型多样（H2、CO2、甲酸、甲醇、乙酸等），且对环境具有较强的适应性[29]。Kong 等[30]利用猪粪和玉米秸秆为底物进行厌氧消化发现，当VFAs高于234.3 mg·L-1 时，甲烷八叠球菌目的丰度较高。本研究的结果也发现，在试验后期当3种处理的VFAs含量全程在1 708.77 mg·L-1以上时，甲烷八叠球菌目的相对丰度较高为优势菌群，同时也证明了甲烷八叠球菌目在高水平VFAs的环境中可以占据优势，更容易成为产甲烷菌的优势菌种[31]。RDA分析也进一步证明甲烷八叠球菌目与VFAs存在负相关关系，说明甲烷八叠球菌目是厌氧消化反应器中VFAs的主要消耗者。

细菌群落中纤维杆菌属为厌氧消化反应体系中常见的纤维素降解细菌[31]。RDA 分析结果表明，纤维杆菌属促进了VFAs和COD的产生，这与Nguyen等[32]发现高丰度的纤维杆菌属在以木质纤维素为主的反应器中促进了COD 和 VFAs产生的结果一致。在3种TS处理中，纤维杆菌属的丰度至试验结束时均高于起始含量，说明纤维杆菌属在不同TS处理试验全程均正常参与纤维素降解。脱硫弧菌目一方面有助于厌氧消化体系pH中和以及病原体的去除，另一方面，脱硫弧菌目与产酸、产甲烷菌在内的多种参与厌氧消化过程的微生物存在竞争，且自身产物H2S对甲烷存在一定的毒性[33]。Huang等[34]发现，厌氧消化中硫酸盐还原细菌与甲烷产量呈负相关。本试验中检测的硫酸盐还原细菌中脱硫弧菌目同样与甲烷含量存在负相关，脱硫弧菌目相对丰度越高，甲烷产量越低，说明脱硫弧菌目相对丰度在玫瑰秸秆的厌氧消化中同样会给甲烷产量带来显著的负面影响。本研究发现，厌氧消化系统中前期大量的VFAs积累和脱硫弧菌目较高的相对丰度可能对厌氧消化体系及甲烷菌的生存环境有较大的影响，因而造成试验前期3种TS处理均存在较长时间的延滞期，并且这种表现随TS含量升高，延滞期相对更长。本研究表明，TS含量会显著影响厌氧消化反应中的理化因子与微生物菌群的活性和丰度，因此，选择适合的TS含量对提高玫瑰秸秆厌氧消化系统的效率具有重要意义。

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