基于抗氧化作用成分的黄精炮制工艺优化

赵秋华　潘乔丹　黄嫊琳　黄宏珍　张忠伟　薛强

【摘 要】 目的：探讨黄精炮制前后的抗氧化活性成分含量变化及抗氧化作用的相关性，优选出基于抗氧化作用的黄精炮制工艺。方法：采用正交试验法优化黄精的炮制工艺，以蒸制时间、蒸制次数、加黄酒量、黄酒焖润的时间为考察因素，以酒黄精外观性状、5-羟甲基糠醛含量、多糖含量及抗氧化能力作为考察指标综合评分，通过有效成分及药理作用相结合综合评价黄精的炮制工艺。结果：黄精经炮制产生5-羟甲基糠醛（5-HMF），多糖含量增加，炮制后增强抗氧化能力，黄精酒制最佳工艺为黄精加入20%黄酒，焖润6 h，隔水蒸制9 h，烘干后再重复蒸制，共蒸制三次。结论：采用正交试验法优选黄精酒制工艺得出的炮制品色黑味香甜，酒制黄精可以增强黄精体外抗氧化能力，5-羟甲基糠醛含量比多糖含量对黄精抗氧化作用的影响较大。

【关键词】 黄精；炮制；5-羟甲基糠醛；黄精多糖；抗氧化

【中图分类号】R28 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）10-0061-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.10.zgmzmjyyzz202410013

Optimization of Processing Technology for Polygonatum Sibiricum Based on Antioxidant Effect

ZHAO Qiuhua1，2 PAN Qiaodan1，2 HUANG Sulin1 HUANG Hongzhen1 ZHANG Zhongwei1，2 XUE Qiang1

1.College of Pharmacy，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000， China；

2. Key Laboratory of Characteristic Ethnic Medicine Research in the Youjiang valley of Guangxi Universities，  Baise 533000， China

Abstract：Objective Explore the correlation between the content changes of antioxidant active ingredients and antioxidant effects before and after processing， Optimize the processing technology of Polygonatum sibiricum Based on Antioxidant Effect. Methods Using orthogonal experimental method to optimize the processing technology of Polygonatum sibiricum， Taking steaming time， steaming frequency， amount of yellow wine added， and soaking time of yellow wine as factors to investigate，Using the appearance characteristics， 5-hydroxymethylfurfural content， polysaccharide content， and antioxidant capacity of Polygonatum sibiricum as evaluation indicators，Comprehensive evaluation of the processing technology of Polygonatum sibiricum through the combination of effective ingredients and pharmacological effects. Results Polygonatum sibiricum produce 5-HMF after processed， with an increase in polysaccharide content. After processing， it enhances antioxidant capacity， The best processte chnology for Polygonatum sibiricum is to add 20% yellow wine to it， simmer for 6 hours， steam over water for 9 hours， dry and repeat steaming three times. Conclusion The processed Polygonatum sibiricum obtained by optimizing the production process using orthogonal test method has a black color， sweet taste， and can enhance the antioxidant capacity of Polygonatum sibiricum in vitro. The content of 5-hydroxymethylfurfural has a greater impact on the antioxidant effect of Polygonatum sibiricum than the content of polysaccharides.

Key words：Polygonatum Sibiricum;Processing Technology; 5-hydroxymethylfurfural; Polysaccharide;Antioxidant

黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua.的干燥根茎，性平，味甘，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效［1］。主产于广西、四川、贵州等地，是我国传统的药食同源中药材，具有较高的药用价值［2］。黄精主要含有多糖、甾体皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇及挥发油等化学成分［3］。现代药理研究表明，黄精具有抗衰老和抗氧化［4-5］、抗肿瘤［6］、预防神经毒性［7］、降血糖［8］、改善学习记忆［9］、调节免疫［10］等药理作用。黄精生品中含有大量的粘液质，皮肤直接接触会有瘙痒感，直接使用会刺激咽喉，故而常需炮制入药，主要目的是为了降低毒性、增强疗效［11］，酒制是黄精传统的炮制方法之一，酒黄精可除去麻味，以免刺激咽喉，还能助其药势，更好地发挥补益作用。目前对于黄精炮制方法的研究多参照《中国药典》方法，但缺乏统一的标准，欠缺以黄精药效作用为标准来探讨其炮制方法的研究。

课题组经过前期研究，发现黄精抗氧化作用是黄精多成分共同作用的结果，其中5羟甲基糠醛 （5-hydroxymethylfurfural，5-HMF） 贡献较大［12］。本研究采用正交试验法优化黄精的炮制工艺，采用DPPH法探究黄精的抗氧化能力，通过有效成分及药理作用相结合综合评价黄精的炮制工艺，为黄精抗氧化作用的药效物质基础提供参考依据，促进黄精的进一步开发与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 黄精购于广西百色凌云县，经右江民族医学院黄元河副教授鉴定为百合科多花黄精的根茎。5-羟甲基糠醛标准品（5-HMF，批号H12M9Z61023，上海源叶生物科技有限公司）；D（+）-无水葡萄糖标准品（批号080M00143V，上海源叶生物科技有限公司）；2-2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH，批号D807297，上海麦克林生化科技有限公司）；维生素C片（批号220203，广西恒健制药有限公司）；黄酒（绍兴女儿红酿酒有限公司）；色谱级乙腈（默克公司）；色谱级甲醇（默克公司）。其余试剂为分析纯，水为超纯水。

1.2 仪器 依利特Agress 1100液相色谱仪；InertsilODS-3色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；UV-2700紫外分光光度计，GFL-230电热鼓风干燥箱；HC-5002S数控型台式超声波清洗机。

1.3 方法

1.3.1 酒黄精的制备

1.3.1.1 生品黄精的制备 取鲜黄精除去泥沙杂质及非药用部位，洗净，切成厚片，晒干，即得黄精生品，备用。

1.3.1.2 正交试验炮制酒黄精［13-14］ 每组均称取黄精生品50 g，采用L9（34）正交试验表设计实验（因素水平见表1），以蒸制时间（A）、蒸制次数（B）、加酒量（C）、焖润时间（D）为考察因素，以炮制后的酒黄精的外观性状评分、多糖含量、5-HMF含量及DPPH自由基清除率为考察指标，按照L9（34）正交试验表进行实验，将生品黄精加黄酒焖润，至蒸笼内蒸制，蒸制后的酒黄精烘箱50℃烘干。

1.3.1.3 黄精外观形状评分及综合评分方法 为了客观合理的对黄精酒制工艺进行优选，在本实验中以黄精的外观性状（包括色泽、气味、口感、质地四者评分的之和）、黄精多糖含量、5-HMF含量及抗氧化能力为评价指标，黄精多糖含量的加权系数为0.3，5-HMF含量的加权系数为0.3，外观性状加权系数和黄精抗氧化能力的加权系数分别定为0.2，外观性状加权评分＝（该样品外观性状评分/9个样品中最高外观性状评分）×2， 黄精多糖含量加权评分＝（该样品黄精多糖含量/9个样品中黄精多糖最高含量）×3， 5-HMF含量加权评分＝（该样品5-HMF含量／9个样品中5-HMF最高含量）×3， 黄精抗氧化能力加权评分＝（该样品抗氧化能力/9个样品中抗氧化能力最高）×2。综合评分＝外观性状加权评分＋黄精多糖含量加权评分＋5-HMF含量加权评分+黄精抗氧化能力加权评分。外观性状的评分标准参照2020年版《中华人民共和国药典》中酒黄精的性状［1］（详见表2）。

1.3.2 紫外-分光光度法测定黄精多糖含量

1.3.2.1 对照品溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品20 mg，置于锥形瓶中，加入适量的蒸馏水超声溶解，转移至100 mL的容量瓶中，加入蒸馏水定容至100 mL，即得0.2 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

1.3.2.2 供试品溶液的制备 精密称取“1.3.1.2”项黄精炮制品及生药各5 g，加水40 mL，超声提取1 h，过滤，再加水提取0.5 h，合并滤液，浓缩至10 mL，加入无水乙醇沉淀24 h，过滤，蒸发除去乙醇，得到粗多糖，加蒸馏水定容至100 mL，取出0.1 mL稀释定容至100 mL容量瓶中备用。

1.3.2.3 样品溶液中多糖含量的测定 精密量取制备好的供试品溶液，各组2 mL，分别置于10 mL刻度试管中，先向试管中加入6%苯酚0.9 mL，摇匀，迅速加入硫酸5.5 mL，摇匀，于90℃水浴中保温30 min，取出，置冰水浴中5 min，以蒸馏水作空白组，于分光光度计上测定吸光度。

1.3.3 高效液相法测定酒黄精5-羟甲基糠醛含量

1.3.3.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex-C18（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；检测波长：284 nm；流动相：甲醇-水（18∶[KG-*3/5]82）；柱温：30℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min。

1.3.3.2 标准品溶液的制备 取5-HMF标准品20 mg，置10 mL容量瓶中，加入适量甲醇定容至刻度，配制成浓度2 mg/mL标准品母液；精密量取0.5 mL标准品母液至50 mL容量中，用适量甲醇稀释定容至刻度，即得0.02 mg/mL标准品溶液。

1.3.3.3 样品溶液的制备 按正交试验表条件炮制酒黄精，取适量生品组和炮制品（1～9组）药材粉碎，备用。分别取黄精生品组、各组黄精炮制品粉末约2 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入甲醇10 mL，超声20 min，滤过，滤渣再分别加入甲醇10 mL，超声10 min，滤过，合并滤液至25 mL容量瓶中，用适量甲醇定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.3.3.4 样品中5-HMF含量的测定 取按照“1.3.3.3”项下制备得的样品溶液，按照“1.3.3.1”项下的色谱条件依次进行进样分析，即得生品组、黄精酒制品（9组）共10组样品的峰面积，采用外标法计算这10组样品中5-HMF的含量。

1.3.4 抗氧化活性测定

1.3.4.1 阳性对照品的配制 将药品维生素C片研磨粉碎，精密称取0.0080 g维生素C粉末，用甲醇溶解定容至100 mL，即得0.8 mg/mL得维C-甲醇溶液。

1.3.4.2 供试品溶液的制备 精密称定各组黄精粉末约0.2 g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇10 mL，超声提取20 min，滤过，滤渣再分别加入甲醇10 mL，超声10 min，滤过，合并滤液至25 mL容量瓶中，用适量甲醇定容，依次取0.1 mL样品溶液，用适量甲醇稀释定容至10 mL容量中，备用。

1.3.4.3 DPPH溶液的制备 精密称定0.0063 gDPPH，用甲醇溶解定容至100 mL棕色容量瓶中，即得0.16 mmol/L的DPPH-甲醇溶液。

1.3.4.4 DPPH自由基清除能力测定 取2 mL“1.3.4.2”项的样品溶液，加入0.16 mmol/LDPPH-甲醇溶液2 mL，充分混匀，避光反应30 min，于517 nm波长测定吸光度Ai；以2 mL甲醇代替DPPH-甲醇溶液并测定吸光度Aj；再以2 mL甲醇溶液代替样品溶液并测定吸光度Ao。平行测定三次，取平均值；以维C作为对照，按以下公式计算清除率：

DPPH清除率（%）=[（Ao-Ai+Aj）/Ao]×100%

公式中，Ai为2 mL稀释后的样品溶液+2 mLDPPH-甲醇溶液吸光度；Aj为2 mL稀释后的样品+2 mL甲醇溶液吸光度；Ao为2 mL甲醇+2 mLDPPH-甲醇溶液吸光度。

2 结果与分析

2.1 紫外-分光光度法测定黄精多糖的含量

2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制 精密称取无水葡萄糖标准品20 mg，定容于100 mL容量瓶，取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和2 mL置于具10 mL刻度线试管中，分别加蒸馏水至2 mL，每管加入6%苯酚溶液0.9 mL，摇匀后迅速加入浓硫酸溶液5.5 mL，振荡混匀后置于90℃热水浴中保温30 min，取出再放入冰水浴中5 min，于紫外分光光度计490 nm处测吸光度，得到标准曲线Y=1.1656X+0.0812，R2=0.9997。

2.1.2 黄精多糖的含量测定 本实验采用水提醇沉的方法提取各组黄精炮制品的粗多糖，采用紫外-分光光度法对黄精多糖进行含量测定，结果显示，黄精经过酒制后的多糖均比生品的含量高，多糖含量最高达到75.24 mg/g，远超出《中国药典》的含量测定要求（含黄精多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于4.0%）。多糖含量由高到低依次为第3组>第9组>第7组>第2组>第5组>第8组>第4组>第6组>第1组>生药组（详见表3）。

黄精多糖是黄精的主要活性成分之一，也是用于评价黄精的质量标准的一个重要因素。研究表明［15］黄精多糖在临床应用上具有使血糖血脂降低、提高学习能力、增强记忆能力、抗氧化等作用。黄精在经过炮制后多糖的含量会发生先增加后减少的变化，在蒸制过程中多糖物质会发生水解，生成了葡萄糖和果糖等物质。

2.2 高效液相法测定酒黄精5-羟甲基糠醛含量

2.2.1 标准曲线的绘制 分别取“1.3.2.2”项下制备的标准品溶液0.5 μL、1 μL、2 μL、10 μL和20 μL，按照“1.3.2.1”项下的色谱条件依次进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，最终得标准曲线y=8457.2x+10.893，r2=0.9999。结果如图1所示。

2.2.2 5-HMF含量的测定 分别取黄精生品组、各组黄精炮制品粉末约2 g，按照1.3.3.3项制备样品溶液，采用HPLC测定黄精中5-HMF的含量，按照“1.3.3.1”项下的色谱条件依次进行进样分析，采用外标法计算生品组、黄精酒制品（9组）共10组样品中5-HMF的含量。如图2所示，黄精生品中无5-HMF化学成分，黄精炮制后产生了5-HMF化学成分，其中5-HMF含量最高达到19.30 mg/g，5-HMF含量由高到低依次为第9组>第3组>第7组>第5组>第2组>第4组>第6组>第8组>第1组（详见表4）。

5-HMF是葡萄糖焦糖化反应和美拉德反应的典型产物之一，已有研究［16］证明5-HMF具有多种药理活性，但超过一定剂量时会产生明显的毒性，所以测定其在炮制过程中的含量变化对黄精炮制研究也具有一定的意义，且早有研究者提出在黄精炮制过程中增加对5-HMF含量的测定［17］。

2.3 黄精不同炮制品抗氧化活性的测定 DPPH自由基结构简单、性质稳定、反应容易控制，是未来抗氧化剂自由基清除活性筛选的首选试剂［18］，其作用原理主要是利用自由基清除剂提供一个电子与DPPH自由基的孤对电子配对，使自身紫色变为黄色，在517 nm波长处的吸光度变小，即自由基清除剂的清除能力越强，吸光度越小［19］，该法操作简单、方便。本实验采用DPPH自由基测定黄精抗氧化作用，以维生素C作阳性对照，对黄精生品及不同炮制品的DPPH自由基清除能力进行测定，结果显示黄精炮制前后均具有一定的DPPH自由基清除能力，其中以维生素C的能力最强（清除率为97.72%），黄精第6组炮制品次之，黄精生品组最弱，黄精炮制品中DPPH自由基清除能力的强度排序依次为第6组>第5组>第9组>第8组>第4组>第2组>第7组>第3组>第1组（详见表5）。结合表3和表4，通过DPPH自由基清除能力的测定，结果发现通过炮制产生5-HMF，黄精多糖含量增加，黄精多糖、5-HMF与其抗氧化能力存在一定的关联，但不呈正比关系，并非黄精多糖含量越高抗氧化能力越强，也不是5-HMF含量越高抗氧化能力越强，说明其浓度可能影响抗氧化作用，或者还有别的成分共同发挥着抗氧化的作用。文献报道［20］黄精多糖的浓度在一定范围内对清除DPPH自由基的能力存在着一定的剂量依赖性，当浓度达到一定的范围时多糖对清除自由基的能力具有显著性。因此，在炮制时应结合考察药理作用，并不是其活性成分含量越高药理作用越强。

2.4 正交试验优选酒黄精炮制工艺结果 正交试验结果用正交设计助手Ⅱ3.1版进行分析［21］，结果见表6和表7。由表6直观分析可知正交试验酒制工艺各因素的影响强度分别为B>C>A>D，即蒸制次数>蒸制时间>加黄酒量>黄酒焖润时间，由表7方差分析可知各因素对试验结果无显著性影响。经过正交试验，得出黄精酒制最佳工艺为A3B3C2D1，即黄精加20%黄酒，焖润6 h，每次隔水蒸制9 h，共蒸制3次。

3 结论

黄精生品中含有大量的粘液质，皮肤直接接触会有瘙痒感，生嚼会使舌头产生麻木感，直接使用会刺激咽喉，酒制是黄精传统的炮制方法之一，经过炮制后可消除生品黄精的刺激性及副作用，增加了多糖含量，而且产生了5-羟甲基糠醛（5-HMF）。钱红月等［22］通过对江西省黄精加工与炮制的现状进行分析，建议江西的炮制企业尽可能地采用建昌帮炆法炮制黄精工艺的一体化加工工艺体系，以提高黄精饮片品质。因此炮制工艺的考察对黄精化学成分、药理作用和品质影响较大。本研究通过正交试验设计，以黄精的外观性状、多糖含量、5-HMF含量以及清除DPPH自由基的能力为评价指标综合评分，各因素的影响大小依次为蒸制次数>加酒量>蒸制时间>焖润时间，四个因素均无显著性影响。结合黄精抗氧化作用，最终确定黄精炮制的最佳工艺为A3B3C2D1，即蒸制时间为9 h、蒸制次数为3次、加酒量为 20%、焖润时间为6 h。

黄精经炮制前后均具有一定的抗氧化能力，从DPPH自由基清除能力与黄精多糖、5-HMF含量的排序来看，5-HMF比多糖对黄精抗氧化作用影响较大，而且黄精多糖含量、5-HMF含量与抗氧化作用并不呈正比关系，说明还有其他的成分在发挥着抗氧化作用，体现中药多成分综合作用的特点。因此，在炮制时应结合考察药理作用，并不是其活性成分含量越高药理作用越强。该研究通过炮制与药理作用结合，优选黄精的炮制工艺结果，为进一步研究黄精药理作用机制和活性成分提供科学依据，促进黄精的开发与利用。

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（收稿日期：2023-08-04 编辑：杜玲玉珊）

基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（2018KY0445）。

作者简介：赵秋华（1985—），女，汉族，硕士，讲师，研究方向为中药炮制及中药制剂的质量标准研究。E-mail：369910787@qq.com