兽用抗生素生物效价测定中注意事项及分析

郭玉翠 刘晓静 韩镌竹 邱月 张铭洋 李欣南

【摘要】检验检测技术在保障兽用抗生素产品质量中发挥着重要作用。管碟法是抗生素效价测定常用的方法之一。本文针对抗生素效价测定过程中常见的一些技术问题进行总结梳理，结合日常实践，对影响结果准确性的关键环节进行剖析，提出合理化建议，以供兽药检验检测实验室参考。

【关键词】抗生素；效价；管碟法；准确性

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.005

【基金项目】辽宁省检验检测认证中心创新创业项目（SC202319）：一种新型动物营养速溶颗粒剂的开发与应用。

Precautions and Analysis in the Biotiter Determination of Veterinary Antibiotics

GUO Yucui1， LIU Xiaojing2， HAN Juanzhu1， QIU Yue1， ZHANG Mingyang3， LI Xinnan1*

（1.Liaoning Inspection， Examination & Certification Centre〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China； 2.Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China； 3.Dalian Medical University， Dalian 116000， China）

Abstract： Testing technology plays an important role in ensuring the quality of veterinary antibiotic products. The tube plate method is one of the commonly used methods for determining the potency of antibiotics. This article summarized and sorted out some common technical issues in the process of determining antibiotic potency. Combining with daily practice， it analyzed the key links that affected the accuracy of results， and put forward reasonable suggestions for reference by veterinary drug testing laboratories.

Keywords： antibiotics； potency； tube plate method； accuracy

随着现代分析技术的快速发展，很多品种的抗生素微生物检定法都被化学分析方法所取代，但是由于部分抗生素依赖生物发酵生产，化学测定结果难以准确表征抗生素的组分组成以及含量与生物活性间的关系，某些抗生素目前尚无适当的化学分析方法表征其活性。因此，抗生素微生物检定法便成了不二的选择。在《中华人民共和国兽药典》（2020年版）与《兽药质量标准》（2017年版）含量测定的方法要求中，有54种药物制剂运用了抗生素微生物检定法。其中包括氨基糖苷类抗生素制剂23种、大环内酯类抗生素制剂19种、多肽类抗生素制剂6种、四环素类抗生素制剂4种，其他抗生素制剂2种。由此可见，未来抗生素微生物检定法在抗生素含量检测技术中仍占有重要地位。

抗生素微生物检定法包括管碟法与比浊法。管碟法是抗生素效价测定的经典方法，通常采用活菌检测[1]。其主要依据量反应平行线原理，将菌悬液与培养基混合均匀，覆盖在底层培养基上，然后置放加入了抗生素与标准品的钢杯。抗生素在培养基内扩散，当扩散到达一定范围时能够抑制试验菌的生长，形成透明的抑菌圈。比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算供试品抗生素活性（效价）[2]。管碟法具有成本低、准确性高、能直接显示抗生素的抗菌效果等优点，但环境要求严苛，对技术人员的能力要求高，工作效率相对偏低。基于此，本文梳理了兽用抗生素微生物检定法中常见的问题并进行原因解析，以期为提升兽药检测实验室的检测能力与促进动物产品质量发展提供帮助。

1试验准备阶段注意事项

1.1菌种

1）菌株的传代与保存。通常实验室标准菌株会在-80℃或-20℃保存，在使用前要进行复苏和活化，如果没有充分的复苏与活化，会直接导致试验失败[3]。《中华人民共和国兽药典》（2020版）附录9203中要求冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。另外，工作菌株传代次数应严格控制，不能超过5代，以防止过度传代增加菌种变异的风险。

2）菌株的活性。菌株的活性是试验成败的关键因素[4]。因此在不能掌握菌浓和菌株活性的情况下，可以先做预实验。当使用枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆进行抗生素含量测定时，需保证芽孢生成率，应采用革兰染色法涂片镜检，芽孢率≥85%。

3）菌体的富集。制备菌悬液需要培养足够的菌苔，要严格控制温湿度，防止出现水汽过重产生斜面菌苔薄及观察受阻的情况。

4）特殊菌种要求。金黄色葡萄球菌冷冻保藏的时间短，建议半年更换一次菌种，否则试验菌活性会大大减弱，造成实验结果出现误差。藤黄微球菌自我保护能力差，在复活及传代过程中易导致传代失败，须及时更新传代。

1.2培养基

1）培养基的制备。兽药检测实验室一般采用脱水培养基，称量要保证精确度，且加入的水量要严格控制。脱水培养基应完全溶解后，再进行分装灭菌，避免因琼脂分布不均匀导致培养基灭菌后分层，若需要加热助溶，则要避免过度加热。

2）培养基的灭菌。培养基的灭菌要严格按照生产商提供的说明书进行，避免因过度灭菌导致营养成分被破坏。培养基的理化性质能够影响抑菌圈的形成，如pH越高，生成的抑菌圈小。碱性条件下抗生素的灭菌作用被减弱，因此在灭菌后需要对配制好的培养基及缓冲液的pH值进行校对。如果培养基给出具体pH值，则pH值的范围不能超过规定值的±0.2。

3）培养基的验证。不同批次培养基所提供的营养物质能导致菌落性状产生差异。营养丰富的培养基上细菌分裂繁殖速度较快，产生的抑菌圈相对较小，反之，产生的抑菌圈较大。为保证测量的准确性，培养基在启用前要进行培养基验证，除包装、性状、pH值等外还应进行适用性检查试验，一般同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。

4）培养基的贮藏。培养基灭菌后应尽量立即使用，不得在高压灭菌器长时间放置。培养基灭菌后再融化只允许一次。短时间放置可于45～50℃的水浴中保温，不得超过8 h。如果需要长时间保存应自然冷却后在冰箱中（4～8℃）保存，一般不超过一周，不得在0℃以下保存，避免破坏琼脂特性。

1.3标准物质

兽用抗生素生物效价测定应按标准要求选用效价用标准物质。标准物质的保存要严格按照说明书进行，要定期对标准物质进行期间核查，确保标准物质满足量值溯源的要求。

1.4其他注意事项

1）培养皿。试验用培养皿要使用直径约为90 mm，高16～ 17 mm的定量平皿。

2）陶瓦盖。陶瓦盖使用前要充分烘干，避免水汽堵塞缝隙影响水蒸气吸收。

3）钢杯。内径为6 mm±0.1 mm，高为10.0 mm±0.1 mm，外径为7.8 mm±0.1 mm。试验前应检视钢杯，边缘应光滑整齐，内壁无残留物，无锈蚀。要及时更换污损的钢杯，避免影响实验中抗生素的扩散。此外，钢管的重量也会影响药物在琼脂中的扩散，为避免钢管重量差异对药物扩散产生影响而造成结果不准确，在同一试验中使用的钢管，内外壁及两端均应光滑平整，重量差异应不超过±0.05 g。

2检测过程中的注意事项

2.1双碟的制备

1）菌悬液的制备。取新鲜试验菌斜面培养物，在无菌条件下用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗掉，通过预试验确定适宜菌浓。

2）底层的制备。为使培养基在平皿底部均匀摊布，加热融化的培养基可直接倾注，且体积为20 mL，自然冷却至凝固。吸取培养基时要轻吸慢放，避免产生气泡。试验台应使用水平尺进行校准，避免培养基表面倾斜影响检测的准确性。

3）菌层的制备。取培养基适量加热溶解后置于48～50℃水浴中至恒温，加入适量菌悬液迅速混匀，取5 mL加注底层上迅速均匀摊布。制备上层时要尽量快，同时室温不宜过低，避免琼脂凝固导致表面不平从而影响检测的准确性。

4）钢圈放置。建议使用钢圈放置器，避免人工放置引入的误差。钢圈放置后应静止5 min。

5）上样。使用移液器上样时应避免枪头与钢圈接触，防止漏液发生。出现漏液、迸溅等情况应及时剔除。上样要平稳且迅速，一组样品的上样时间应控制在3 min内[5]。

2.2培养

1）放置陶瓦盖。目前，有些实验室已经不使用陶瓦盖，但要控制好实验室的湿度，避免水汽凝结滴落影响实验。同时湿度较高也会导致菌层生长异常和杂菌污染。

2）恒温培养。双碟放入培养箱时尽量将同一批样品放置在同一区域，同时在培养期间要监控温度波动，严格控制培养温度和培养时间。

3）测量。手工测量用的游标卡尺应通过检定，测量时为减少误差应由两名检测人员同时测量。使用抑菌圈测量仪测量，测量前要剔除结果异常的双碟，然后进行扫描测量，至少重复测量1次。

3常见问题分析

3.1抑菌圈异常

1）无抑菌圈。发生此类情况，多半是试验菌本身活性减弱或培养条件不适宜。一般优先考虑是否因为制备双碟时，菌层培养基没有冷却至指定温度而导致细菌死亡。其次可能是湿度不符合细菌生长要求，如枯草芽孢杆菌在湿度较大的条件下不易生长。此外需要注意的是，细菌活化后在斜面上不宜保存太久。保存菌种冻存时间太长或经过反复活化冻存，都可能造成细菌活性减弱，双碟无细菌生长。

2）抑菌圈大小不在规定范围内。《中华人民共和国兽药典》（2020年版）规定，二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径应在18～22 mm。当双碟细菌生长良好，但试验结果不符合要求时，一般情况下是细菌浓度不符合，应调节菌浓，如距离要求太大，需以十倍增加或减少试验菌的添加量。其中，土霉素对藤黄微球菌的抑菌性高，试验使用的菌悬液浓度也比较高，所以土霉素的标准品溶液和供试品溶液的高、低浓度应在规定范围内选择浓度值低的，避免试验需要使用的菌悬液浓度太高，无法达到要求。

3）抑菌圈大小不均一。出现这种情况一般是由于试验菌活性差、菌层试验菌溶液未与培养基混合均匀，导致每碟的菌层试验菌溶液添加量不一致，进而使每个双碟的细菌量不同，同一药物浓度产生的抑菌圈大小便不一致。

4）抑菌圈有“小耳朵”。钢管在培养基中应保持沉降深度相同，溶液扩散均匀一致。如果移动双碟时没有平行移动，双碟震动时，会造成小钢杯与培养基出现缝隙，溶液容易侧漏[6-7]。此外，加样时触碰到钢杯也会使钢杯与培养基出现缝隙，导致药液从小钢杯中漏出，造成抑菌圈出现“小耳朵”（见图1）。加样时过快按动移液枪，导致药液外溅，抑菌圈会出现图2所示的情况。为了避免钢杯与培养基接触不紧密而造成抑菌圈出现“小耳朵”的结果，应对钢杯定期用超声波振荡，处理时需要清洁彻底，防止培养基残留在钢杯内壁。