动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考残留的测定

【摘要】建立高效液相色谱法测定动物可食性组织中氟苯尼考、氟苯尼考胺和甲砜霉素残留量。试样经过乙腈-乙酸乙酯-氨水（体积比5∶15∶80）混合提取液提取，4%氯化钠溶液和正己烷液分配净化，再经HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。结果表明，甲砜霉素在25～5000 ng/mL、氟苯尼考胺和氟苯尼考在5～500 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，甲砜霉素检测限为10μg/kg，氟苯尼考及氟苯尼考胺检测限为2.0μg/kg，回收率均值为73.6%～91.2%，批内、批间RSD值均小于20%。本方法专属性强，灵敏度高，适用于动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考残留的测定。

【关键词】动物可食性组织；氟苯尼考；氟苯尼考胺；甲砜霉素；高效液相色谱法

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.002

Determination of Thiamphenicol， Flufenicomide and Flufenicol Residues in Edible Animal Tissues

LIU Kai

（Liaoning Inspection， Examination & Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： A high-performance liquid chromatography method has been established for the determination of flufenicol， flufenicomide， and thiamphenicol residues in edible animal tissues. The sample was extracted with a mixed extraction solution of acetonitrile-ethyl acetateammonia （volume ratio 5∶15∶80） and purified by 4% sodium chloride solution and n-hexane liquid-liquid distribution， and then purified with HLB solid-phase extraction column. The sample was determined by high-performance liquid chromatography and quantified using an external standard method. The results showed that there was a good linear relationship between the concentration range of 25 ng/mL to 5000 ng/mL of thiamphenicol， and between the concentrations of 5 ng/mL to 500 ng/mL of flufenicol and flufenicomide. The detection limit of thiamphenicol was 10μg/kg， while that of flufenicol and flufenicomide was 2.0μg/kg. The average recovery was 73.6% to 91.1%， and the RSD were<20%. This method is suitable for the determination of thiamphenicol， flufenicomide， and flufenicol residues in edible tissues of animals.

Keywords： edible tissues of animals； flufenicol； flufenicomide； thiamphenicolresidues； high performance liquid chromatography method

甲砜霉素和氟苯尼考是氯霉素的主要替代品，应用较广，具有潜在的体内蓄积危险[1-3]，并且由于操作不慎引起残留的可能性很大。因此，甲砜霉素和氟苯尼考胺可能在动物可食性组织中发生残留。

GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定，在牛、羊、猪、家禽、鱼的靶组织中，甲砜霉素的最大残留限量均为50μg/kg；氟苯尼考在猪肉、猪皮+脂、猪肾、猪肝、禽肉、禽皮+脂、禽肾、禽肝、牛/羊肉、牛/羊肾、牛/羊肝、鱼肉+皮的最大残留限量分别为300、500、500、2000、100、200、750、2500、200、300、3000、1000μg/kg。

目前，美国采用GC/MS法、欧盟和日本均推荐HPLC法测定组织中氟苯尼考的残留量[4-6]。国内对于动物可食性组织中氟苯尼考（FF）、氟苯尼考胺（FFA）和甲砜霉素（TAP）检测的研究主要集中于三方面：一是水产品中氟苯尼考、氟苯尼考胺的检测[7]，二是动物可食性组织中甲砜霉素和氟苯尼考的同时检测[8-10]，三是液相色谱质谱法、气相色谱质谱法对氯霉素类药物的残留检测[11-13]。而对于动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的同时检测却未见报道。

因此，制定动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺和氟苯尼考的检测方法，可以大大提高甲砜霉素、氟苯尼考胺和氟苯尼考检测效率，在促进畜牧业可持续发展，保障人民身体健康，维护国家食品安全等方面都具有重要意义。甲砜霉素、氟苯尼考胺和氟苯尼考如图1～图3所示。

1材料与方法

1.1仪器与材料

Waters E2695高效液相色谱（美国Waters公司）；高速冷冻离心机（Biofuge Strators Centrifuge，德国Thermo Fisher Scientific公司）；均质器（PRO250，美国Pro Scientific公司）；氮吹仪（OA-SYS，美国Organomation Associates.Inc公司）；MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）；氟苯尼考对照品（纯度98.0%）、氟苯尼考胺对照品（纯度92.3%）、甲砜霉素对照品（纯度99.7%）、乙酸乙酯（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、氨水（分析纯）。

1.2标准溶液的配制

精密称取氟苯尼考、甲砜霉素、氟苯尼考胺对照品适量（相当于各有效成分10 mg），用乙腈稀释成浓度为100μg/mL对照品储备液，置于-20℃环境中保存。

1.3标准曲线溶液的配制

分别准确吸取甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺标准储备液适量，经初始流动相稀释分别配置成不同浓度的混合标准溶液，其中，甲砜霉素的浓度分别为25.0、50.0、300.0、600.0、2500.0、5000.0μg/L，氟苯尼考胺和氟苯尼考对照品浓度分别为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0μg/L系列对照溶液，上机测定。

1.4方法

1.4.1样品溶液的制备

取试料2 g（精确至±1%）于50 mL离心管中，加提取液（乙腈-乙酸乙酯-氨水，5+15+80）15 mL，涡旋1 min，10，000 r/min离心5 min，移取上清液。残渣用15 mL提取液重复提取一次，合并两次提取液于离心管中，混匀。-20℃冷冻1 h，10，000 r/min离心5 min，上清液置于100 mL鸡心瓶中，加入5 mL正丙醇，50℃减压浓缩至干。加入5 mL 4%氯化钠溶液-甲醇（95+5）溶液溶解残渣，振荡3 min，转入50 ml离心管中，加入5 ml甲醇氯化钠溶液重复溶解残渣，合并溶解液。加入10 ml正己烷，振荡5 min，5000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，再加入10 mL正己烷，重复上述操作，加入0.5 ml氨水，混匀，为备用液。HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水润洗。备用液过柱，依次用3 mL水、3 mL水-甲醇-氨水（180+19+1）淋洗，真空抽干，再用3 mL氨水-甲醇（3.3+ 96.7）洗脱，50℃下氮气吹干，残渣用2 mL流动相溶解过0.22μm滤膜作为试样溶液。供高效液相色谱仪测定。

1.4.2色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，粒径5μm）；流动相：乙腈+0.8 mol/L庚烷磺酸钠离子对缓冲溶液（21+79）；流速：0.7 mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。荧光检测器：激发波长235 nm；发射波长295 nm。

1.4.3检测限与定量限的确定

称取2 g空白组织，加适量混合标准溶液，按样品前处理方法处理后测定。待测物的信噪比S/N>3（按PtP算）为方法的检出限；待测物的信噪比S/N>10（按PtP算）为方法的定量限。

1.4.4方法的添加回收率与精密度

分别制备低、中、高3种浓度水平的阳性添加样品，每种浓度水平进行5份样本分析，重复3次。根据当日的标准曲线和阳性添加样品的响应值，计算样品的提取回收率，并计算样品的批内、批间相对标准偏差。

2结果与分析

2.1方法专属性考察

对照品溶液、空白样品、添加回收色谱图见图4～图34。

图4～图34的结果显示，在本研究的前处理条件和仪器条件下，样品中内源性的杂质对检测无干扰，具有较好的专属性。

2.2线性范围

将峰面积设定为纵坐标，对照溶液的浓度设定为横坐标，得到标准曲线，见表1。

2.3检测限与定量限的确定

甲砜霉素在猪肉、猪皮+脂、猪肾、猪肝、禽肉、禽皮+脂、禽肾、禽肝、牛/羊肉、牛/羊肾、牛/羊肝、鱼肉+皮中检出限均为10μg/kg，定量限为50.0μg/kg；氟苯尼考及氟苯尼考胺在猪肉、猪皮+脂、猪肾、猪肝、禽肉、禽皮+脂、禽肾、禽肝、牛/羊肉、牛/羊肾、牛/羊肝、鱼肉+皮中检出限均为2.0μg/kg，定量限为10.0μg/kg。

2.4方法的添加回收率与精密度

采用标准添加法，在空白组织中添加高、中、低3种浓度的混合标准工作液进行精密度和准确度的测定，每次5个重复，并进行3次重复实验。由表2～表5可知，在高、中、低3种浓度下，

甲砜霉素的回收率在71.8%～98.7%，氟苯尼考胺的回收率在70%～ 98.6%，氟苯尼考的回收率在70.2%～99.4%，批内变异系数≤13.2%；批间变异系数≤7.8%。

3讨论

3.1流动相的优化

本实验使用高效液相色谱仪[14-17]，A泵入磷酸盐溶液，B泵入乙腈，通过调节两泵流速，从而改变流动相极性。当乙腈比例从15%调节到40%时，各待测物质的出峰时间均缩短；当乙腈比例是21%时，各待测物峰与杂质峰充分分离，峰形较好。由于氟苯尼考胺为弱碱性极性的性质，在C18反相色谱柱中几乎不保留[18-21]，因此本实验采用离子对色谱原理进行分析。本实验采用的离子对试剂是庚烷磺酸钠，与氟苯尼考胺生成弱极性离子对，弱极性离子对分布在疏水固定相表面，然后再被流动相洗脱下来。随着庚烷磺酸钠浓度的增加，氟苯尼考胺出峰时间不断延长，当庚烷磺酸钠浓度达到0.8 mol/L时，氟苯尼考胺与杂质峰充分分离，峰形较好。

3.2光谱条件的确定

较紫外检测器检测，本实验采用的荧光检测器样品杂质峰少、干扰少，可将甲砜霉素、氟苯尼考与氟苯尼考胺与组织中的其他组分完全分开，而且荧光检测器灵敏度更高[22-24]。根据文献报道，将激发波长从200～280 nm，发射波长从255～400 nm做依次检测，确定在激发波长235 nm，发射波长295 nm荧光条件下，可获得较大的甲砜霉素、氟苯尼考与氟苯尼考胺信号。

3.3提取溶剂的选择

甲砜霉素与氟苯尼考属于弱极性化合物，微溶于水，易溶于有机溶剂。氟苯尼考胺极性强，微溶于水，在弱碱性条件下以分子状态存在，易溶于有机溶剂[25-27]。本实验比较了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氨化乙酸乙酯（体积比2∶98）、氨化乙腈（体积比2∶98）、氨水乙酸乙酯乙腈混合提取液（体积比2∶49∶49）、氨水乙酸乙酯乙腈混合提取液（体积比5∶15∶80）。结果表明：乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氨化乙酸乙酯（体积比2∶98）、氨化乙腈（体积比2∶98）、氨水乙酸乙酯乙腈混合提取液（体积比2∶49∶49）对甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率较好，回收率较高，但对氟苯尼考胺的提取效率较差，回收率较低。氨水、乙酸乙酯、乙腈混合提取液（体积比5∶15∶80）对甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺的提取效率较好，回收率较高，而且杂质峰相对较少。

4结束语

本试验建立的样品前处理分析方法净化效果好，灵敏度高，甲砜霉素检测限为10μg/kg，氟苯尼考及氟苯尼考胺检测限为2.0μg/kg，回收率均值为73.6%～91.1%，批内、批间RSD< 20%。空白基质对检测上述3种药物无干扰，专属性强，适用于动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考残留的测定。

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【作者简介】

刘凯，女，1975年出生，高级畜牧师，学士，研究方向为畜产品药物残留检测。

（编辑：李钰双）