RPA技术在金葡菌检测中的研究进展

摘 要：金黄色葡萄球菌可以在人体内外寄生或污染食物，导致皮肤溃烂、免疫力下降和食物中毒等一系列症状，对人体健康构成危害。重组酶聚合酶扩增技术具有反应温度低、反应速率快和特异性高的特点，在不需要精密仪器的情况下能够更准确、高效、快速地检测出金黄色葡萄球菌。本文主要通过综述重组酶聚合酶扩增技术在金葡菌检测中的国内外现状以及其反应机理、引物设计方法等内容，探讨了其中的意义和存在的问题，并展望了该领域未来的发展前景，旨在为公共卫生和食品安全领域提供可行的解决方案。

关键词：金黄色葡萄球菌；重组酶聚合酶扩增技术；等温扩增技术；引物

Research Progress of RPA Amplification Technique in Detection of Staphylococcus aureus

ZHOU Yuxuan， WU Xuemei， SONG Shaozheng*

（School of Health and Nursing， Wuxi Taihu University， Wuxi 214000， China）

Abstract： Staphylococcus aureus can parasite or contaminate food inside and outside the human body， resulting in a series of symptoms such as skin ulceration， decreased immunity and food poisoning， posing a hazard to human health. Recombinase polymerase amplification technology has the characteristics of low reaction temperature， fast reaction rate and high specificity， and can detect Staphylococcus aureus more accurately， efficiently and quickly without the need of precision instruments. Therefore， this paper mainly reviewed the current situation of RPA amplification technology in Staphylococcus aureus detection at home and abroad， the reaction mechanism of recombinase polymerase amplification， primer design methods and other contents， discussed the significance and existing problems， and looked forward to the future development prospects of this field， aiming to provide feasible solutions for public health and food safety.

Keywords： Staphylococcus aureus; recombinase polymerase amplification; isothermal amplification technique; primer

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）也称“金葡菌”，是一种常见的食源性致病微生物，在自然界中广泛存在。它主要寄生于人体的皮肤、鼻腔、咽喉、胃肠、痈和化脓疮口中，可引起一系列血液感染和化脓性疾病，对食品和医疗领域造成严重影响[1]。但抗生素的滥用，导致多重耐药性SA大量出现[2]，因此快速有效地检测和监测SA的存在变得至关重要。PIEPENBURG等[3]于2006年首次提出重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术。RPA是一种新型的恒温扩增技术，在25～43 ℃下反应，且反应速度较快，仅需5～15 min[4]。该技术不需要精密仪器，适用于现场快速检测[5]，因此在相关领域学者中备受关注。本文通过总结RPA技术在金葡菌检测中的国内外研究现状、引物设计、探针设计等内容，并展望了RPA技术在未来的发展前景，旨在为公共卫生和食品安全领域提供参考。

1 国内外研究现状

1.1 发文量统计

2006年，Piepenburg首次提出RPA技术，至今一直是学者们研究的热点。但目前利用RPA技术进行SA检测的研究仍相对较少。通过PubMed和知网两个数据库进行关键词检索，时间范围限定为2006—2023年，分别输入“Recombinase Polymerase Amplification; Staphylococcus aureus”“重组酶聚合酶扩增技术；金黄色葡萄球菌”，发现RPA技术应用于SA快速检测的发文量目前较少，两个数据库合计发文量仅11篇，且主要集中在RPA技术应用于医学检验、微生物检验等领域的笼统概括，缺少具体的综述。

1.2 国内研究现状

近年来，国内研究人员开始探索利用RPA技术进行SA的快速检测。以往的研究表明，RPA技术在SA检测中具有很高的特异性和灵敏度。例如，徐健皓等[6]基于exo-RPA技术原理，针对SA设计了多套RPA引物和含有修饰荧光基团和淬灭基团的RPA荧光探针，并构建了SA-exo-RPA检测体系，增强了SA的检测率，证明了RPA技术在SA检测中的潜力。此外，研究人员还联合使用RPA技术与其他检测方法，如王雨[7]通过将RPA与横向流动试纸条相结合来检测SA，在研究中发现可以使敏感度达

20 CFU·mL-1，显著提高了准确性。高建欣等[8]则是通过将RPA与乳胶微球试纸条相结合，检测限为

1.2 CFU·mL-1。这些研究结果显示出该方法对SA极为敏感，通过与其他检测技术的结合，RPA技术可以对SA进行更加高效、准确的检测。

综上，国内利用RPA技术进行SA的检测已取得一定的进展，先前的研究也为该技术的优化改进提供了技术支持。但目前仍然面临着一些挑战和限制，如细菌样品中的抑制物和假阳性的干扰、灵敏度和稳定度可进一步提高等。因此，未来还需不断优化RPA技术的条件和方法。

1.3 国外研究现状

外科医生亚历山大·奥格斯顿于1880年给一名位于苏格兰阿伯丁的溃疡患者进行治疗时首次发现金葡菌[9]。自此，国外对SA的研究正式开始。近年来，RPA技术作为一种新兴的核酸扩增方法，不少外国学者进行研究，MUNAWAR[10]的研究表明，RPA技术具有灵敏性高、恒温扩增、适用性广泛等优点，能够在短时间内检测到寡菌量级的菌液，也证明了RPA技术在SA检测中的巨大潜力。但由于RPA技术引物和探针目前还存在一定的技术壁垒，因此外国学者主要对RPA技术与其他检测方法联合应用进行了探索。如将RPA技术与PCR、聚合物絮凝沉降等技术相结合以进一步提高SA检测准确性和可靠性。TRAN等[11]将RPA技术与PCR技术联合使用，创新出了一种基于重组酶聚合酶扩增方法的等温PCR检测方法，提高了SA检测灵敏度，缩短了检测所需的时间。

综上所述，RPA技术在与其他技术联用后可以进一步提高检测结果的准确性和可靠性，对于检测SA有独特优势。未来的研究可以进一步优化RPA反应条件，并探索其在实验室以及野外环境中的应用潜力，推动SA检测技术发展不断向前迈进。

2 方法与技术

2.1 RPA的引物、探针设计

为了获得高效、特异性和稳定的RPA反应，研究者们进行了多方面的优化。①引物的设计对于扩增效果至关重要。RPA技术的引物设计要求通常比较严格，引物的长短对扩增结果起着决定性作用。过短会影响重组率，减慢扩增速度，降低灵敏度；过长会增加产生其他二级结构的可能性，都在一定程度上影响了核酸扩增产量。因此RPA反应引物的推荐长度为30～35个核苷酸[12]。此外，对引物GC碱基的含量应控制在40%～60%，且连续的GC碱基不能超过4个[13]，在引物设计中需注意二聚体和发夹结构的形成。②探针的优化也是关键因素。与一般Taq Man探针相比，RPA探针具有更高的设计要求。RPA反应目标片段长度应少于

500 bp，最佳扩增长度以100～200 bp为宜。如四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF）位点的5’端正常控制在

30 bp，3’端正常控制在15 bp。间隔越大导致基底值越高，信噪比越低，因此荧光团与猝灭团通常标记在胸腺嘧啶上，且两者的间距控制在1～5 bp，一般用THF取代1个核苷酸。C3-间隔通常被探针的3’端用来阻断基团进行修饰封闭。

2.2 RPA检测SA的原理

①RPA技术主要基于重组酶和DNA聚合酶的协同作用，使其在无须进行温度变化的环境下高效扩增DNA。因此，在检测SA时，首先识别并结合到双链DNA的特定序列上，其中的DNA聚合酶在单链结合蛋白的保护下，沿着单链模板进行快速且高效的DNA合成。整个过程无须复杂的温度变化，可在23～45 ℃中稳定扩增，且只需15～20 min即可完成目标扩增[14]，节省了时间和成本。②进行RPA检测之前需要进行SA的DNA提取。目前常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和DNA提取试剂盒，其中最主要的是DNA提取试剂盒，其具有简便高效的特点，并且利用其特殊的试剂盒体系和离心柱技术可以快速地提取高质量的DNA。

3 结语

RPA技术具有高灵敏性、特异性和广泛的适用性等优点，操作简单易行，为基层医疗组织和资源匮乏地区快速有效的检测病原菌，提供了可能[15]。但在目前的研究中RPA技术仍存在样本前置处理烦琐、菌液的假阳性干扰大等问题。①在检测SA的研究进展中需要继续优化和改进RPA反应体系，以提高其扩增效率和特异性，并减少阻抗物质对反应的干扰。可通过优化扩增反应体系的组分浓度和反应条件；还可以通过引入新的辅助酶或辅助因子来提高反应效率和特异性。②加强RPA与其他新兴技术的结合。如CRISPR，可以减少非特异性扩增和背景干扰，提高对SA检测的准确性与可靠性。综上所述，利用RPA技术进行SA检测已经取得了显著的研究进展，利用RPA技术进行SA检测具有重要的临床应用前景，在诊断和治疗SA感染方面具有重要意义。

参考文献

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基金项目：江苏省高校自然科学基金（20KJB360007）；江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师项目（苏教师函〔2021〕11号）。

作者简介：周宇萱（2002—），女，安徽马鞍山人，本科。研究方向：生物医学。

通信作者：宋绍征（1984—），男，江苏宿迁人，博士，副教授。研究方向：生物医药。E-mail：ssz0610@163.com。