固相萃取结合液质联用法快速筛查和分析生活饮用水中的56种抗生素

摘 要：目的：建立生活饮用中56种抗生素的固相萃取-液相色谱-串联质谱分析方法。方法：将生活饮用水通过大容量采样管连接到固相萃取柱上净化，用C18柱梯度洗脱分离目标物，以乙腈和0.1%甲酸水为流动相，经电喷雾离子源电离，多反应监测模式串联质谱检测。结果：56种抗生素的最低检测浓度为0.1～2.0 µg·L-1，在其线性范围内的相关系数均大于0.995，3个浓度水平的加标回收率为63.3%～113.0%，相对标准偏差在3.1%～8.3%。结论：该方法前处理简单、快速，适用于生活饮用水中多种抗生素的快速筛查和定量检测。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；固相萃取；生活饮用水；大容量采样管

Rapid Screening and Determination of 56 Antibiotics in Drinking Water by Solid-Phase Extraction Combined with UPLC-MS/MS

CHEN Kun， ZHONG Gemei， WEI Rirong， HUANG Jiangping， LEI Ningsheng， LIAO Yanhua*

（Guangxi Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530028， China）

Abstract： Objective： To develop a method for determination of 56 antibiotics in drinking water by solid -phase

extraction and UPLC-MS/MS. Method： Drinking water is connected to the solid phase extraction column for purification through a large-capacity sampling tube， target object were separated on C18 with gradient elution using acetonitrile-0.10% formic acid as mobile phase and detected by MS/MS using positive electrospray ionization under the multiple reaction monitoring. Result： The minimum detection of 56 antibiotics was 0.1～2.0 µg·L-1. The correlation coefficients in its linear range are over 0.995. The recovery rates of the 3 concentration levels were 63.3%～113.0% with the relative standard deviations of 3.1%～8.3%. Conclusion： The method has simple and rapid pretreatment， and is suitable for rapid screening and quantitative detection of multiple antibiotics in drinking water.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; solid-phase extraction; drinking water; large-capacity sampling tube

近年来，有关新型污染物的话题再次走入公众视野，它被称为“新型污染物”或“新兴污染物”，它一般是指由人类活动造成，在城市污水、地表水、饮用水中被频繁检测出，但因其生产使用历史相对较短或发现危害较晚，尚无法律法规和标准予以规定或规定不完善的污染物。目前，国内外广泛关注的新型污染物主要包括国际公约管控的持久性有机污染物、内分泌干扰物、抗生素等。为加强新型污染物治理，切实保障生态环境安全和公众健康，国家在2022年出台了一系列行动方案[1-3]。抗生素为新型污染物中的一类，其被广泛用于农业、畜禽水产养殖和人类卫生医疗领域的细菌感染治疗[4-5]，主要通过药企制药废水、医院的医疗废弃物不正当排放以及人体或动物和水产饲养用药残留排放进入水体和环境，从而产生污染。

现行的相关抗生素国家标准[6-7]分析方法主要是针对水产品和动物源性食品抗生素的检测，新发布的GB/T 5750.8—2023[8]主要是针对生活饮用水中29种抗生素和10种降压药等个人护理用药的检测，国内暂无环境类标准；美国EPA 1694[9]标准方法中已有利用液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技术，采用同位素标识物为内标物定量测定环境样品中的药物及个人护理用品，检测对象包括7种沙星类抗菌药，6种大环内酯类和1种林可酰胺类抗生素。这些标准方法大多是针对化学结构相似的某一类抗生素的检测[10-15]，

科研文献[16-18]中虽有采用LC-MS/MS检测水中多种抗生素的报道，但同时测定的抗生素种类和目标物数量涉及范围和种类还不够广，且在多种抗生素的同时检测过程中，鲜有文献提及如何在复杂的谱图中快速筛查出目标物。

水中抗生素含量低、干扰大，因此检测时采用固相萃取前处理净化分离和富集技术，将大体积水样通过过柱的方式进行净化富集，再结合具有高通量、高选择性、高准确性及痕量分析能力的LC-MS/MS进行检测。基于国内近年来食品安全风险监测物质、国内外文献报道及管控目标物清单，本文建立了包括喹诺酮类、硝基咪唑类、大环内酯类、磺胺类在内的生活饮用水中56种抗生素的固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）结合LC-MS/MS快速筛查和分析检测方法，为生活饮用水中新型污染物的监测提供方法借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂耗材

仪器：TM5500超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（AB SCIEX 5500，新加坡）；氮吹仪（N-EVAP34美国路易公司）。

试剂耗材：HLB固相萃取小柱（6 mL/500 mg）、大容量采样管（匹配6 mL SPE小柱，1/8in OD，1 mL，1支/包）、EDTA-2Na（分析纯）、甲醇（色谱纯，4 L/瓶）、乙腈（色谱纯，4 L/瓶）、甲酸（色谱纯，4 L/瓶）、标准品：25种磺胺类混标（LOT：2251860，100 mg·L-1，溶剂为甲醇），9种大环内酯类抗生素混标（LOT：2253998，100 mg·L-1，溶剂为甲醇），12种硝基咪唑混标（LOT：2101538，100 mg·L-1，溶剂为甲醇），15种喹诺酮类（LOT：2201585，100 mg·L-1，溶剂为甲醇）购自上海安谱实验科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

分别吸取以上混标1.00 mL用甲醇定容至

10 mL容量瓶中，制备成10.0 mg·L-1混合储备液，保存于-20 ℃冰箱中。根据标准曲线浓度范围依次用初始流动相逐级稀释成系列标准曲线溶液。

1.3 分析步骤

采集1 L水样于预先现场添加6 mg抗坏血酸的1 L的玻璃瓶中，使用0.45 μm滤膜抽滤。用（1+1）盐酸溶液或氨水调节水样的pH值，使水样的pH值为3.5±0.5，再加入0.5 g EDTA，摇匀溶解；后将水样通过大容量采样管连接到预先用6 mL甲醇（色谱纯）和6 mL水活化的HLB柱上，调节流速为5～8 mL·min-1，让水样连续自动输入；上样结束后用10 mL水淋洗小柱，负压抽干HLB小柱，用6 mL甲酸/甲醇（1∶1 000）混合溶液洗脱样品，洗脱液靠重力收集到15 mL离心管中，上述洗脱液在≤40 ℃水浴温度下氮吹至近干，用1.00 mL初始流动相复溶，充分混匀后过0.22 μm滤膜至进样瓶上机测定。

1.4 测定条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（1.7 μm，100 Å，100 mm×2.1 mm）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：3 μL；流动相及洗脱条件见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子方式；检测模式：多反应监测；离子源温度：600 ℃；GS1：55 psi；GS2：50 psi；气帘气：35 psi；喷雾电压：5 500 V；碰撞气：6 psi；校准方法：质量轴自动调谐校准。其他条件见表2。

2 结果与分析

2.1 水样pH值对回收率的影响

本文研究的化合物大多属于酸碱两性化合物，水样pH值会影响其稳定性和存在形态，如在酸性条件下以质子状态存在，在碱性条件下以游离分子状态存在。在酸性条件下提取的文献报道居多，因此本文比较了56种化合物在pH值为2、3、4、5、6条件下的回收率，硝基咪唑类结果回收率在75.3%～102.8%，表明硝基咪唑类化合物回收率良好，受水样pH值影响较小。在接近中性条件下恩诺沙星、氧氟沙星、氟罗沙星回收率接近50%，水样调节为酸性（pH值2～4）后，沙星类抗菌药的回收率有了显著提高，均达到75%以上。大环内酯类化合物受pH值影响较大，pH值为3～4时回收率在65%～105%；pH值为2时，除红霉素外，大多数组分回收率显著下降，这可能与强酸性条件下糖苷键水解有关；部分组分在接近中性条件下回收率下降明显，泰乐菌素、交沙霉素的回收率不到50%。

2.2 仪器条件的优化

由于56种抗生素大多都是含氮化合物，易于质子化，在质谱电喷雾电离模式下易形成[M+H]正离子，且有较强的响应信号，通过针泵进样优化母离子及各碎片离子参数，结合实际样品各离子对基线、杂质干扰峰与响应信号的色谱图，优化后各化合物的离子对信息如表2所示。

正离子模式下，乙腈-0.1%甲酸水流动相体系更有利提高各化合物组分离子化效率，使响应信号更高，峰形更尖锐。通过优化流动相的梯度洗脱条件，大多数有机化合物实现了基线分离，实现了对磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶，磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲异嘧啶，磺胺二甲异噁唑和磺胺二甲唑共4组磺胺类同分异构体的基线分离；对于部分未达到基本分离的极性相近的化合物，质谱检测器的多离子反应监测模式也能进行准确定性定量分析，不影响分析结果。本文通过3轮抽提离子对完成了分析化合物的定性筛查，图1为10 ng·mL-1分析化合物的色谱图。

2.3 基质效应的影响

以水源水空白和末梢水空白为基质，按上述方法测定，添加标准系列浓度的56种抗生素标准溶液复溶氮吹后残渣，绘制基质标准曲线，以之与溶剂（0.10%甲酸水∶乙腈=9∶1）配制的标准溶液响应值比较，用标准曲线斜率的比值评价基质效应的高低。结果显示，56种化合物的基质标准曲线与溶剂标准曲线斜率比值在0.81～1.15，说明基质效应对定量结果的影响可以忽略，可避免每次实际样品检测至少要带5个空白基质样品同时测定用以配制基质曲线的麻烦，减少了检验工作量。

2.4 方法学评价

以空白水源水为基质，加入一定量的标准溶液，在优化的实验条件下（pH值为3.5±0.5），以信噪比为10计算方法的最低检测浓度（定量限）；根据化合物的最低检测浓度，配制标准系列浓度上机测定，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程及相关系数；根据各化合物的线性范围，设置低（0.2～5.0 µg·L-1）、中（5.0～20 µg·L-1）、高（20～100 µg·L-1）3个加标水平，按上述方法测定样品，每个加标水平重复测定6份样品，计算回收率和相对标准偏差，结果见表3。结果表明，56种抗生素的最低检测浓度为0.1～2.0 µg·L-1，r均大于0.995，线性良好，低、中、高3个浓度水平的加标回收率为63.3%～113.0%，相对标准偏差在3.1%～8.3%，满足检测要求。

2.5 实际样品检测

利用本研究建立的方法对南宁市的3份末梢水、3份水源水和3份出厂水进行检测，检出抗生素7种，阳性样品6份，检出的抗生素主要是大环内酯和磺胺类抗生素，含量为0.2～5.8 µg·L-1，提示应加强监测。

3 结论

本研究建立的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定方法能筛查生活饮用水中56种抗生素，涵盖了喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类等人兽两用药物，可以应用于饮用水源抗生素污染调查和生活饮用水水质监测工作。

实验室采用传统的样品过柱模式，工作不仅耗时费力还可能因为重复性劳动导致倦怠而发生操作失误，影响结果准确性。本研究创新性地将样品通过大容量采样管连接到固相萃取柱上，通过压差导流实现净化处理半自动化操作，操作人员能够轻松实现批次处理样品，给未配置多通道全自动固相萃取的实验室提供了一种连续上样的操作模式，以低实验成本提高了工作效率。本研究不仅通过对流动相条件的优化，达到对大部分目标化合物的基线分离，还创新性提出对56种抗生素的保留时间进行分类，通过3轮筛查，可以实现检测数据的快速处理，大大提高实验室批量数据处理能力的同时减少了失误。

综上，本文建立的固相萃取结合液质联用法筛查生活饮用水中56种抗生素的方法，整个过程操作简单，适应了现阶段环境监测检测高通量、操作时间短、定性定量准确等要求，值得在更多抗生素残留的快速筛确证与定量检测工作中推广应用。

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基金项目：广西医药卫生计划课题（Z2015448）

作者简介：陈琨（1982—），女，湖南邵阳人，硕士，副主任技师。研究方向：实验室质量管理与理化检验。

通信作者：廖艳华（1978—），女，广西宜州人，硕士，副主任技师。研究方向：理化检验。E-mail：1907430702@qq.com。