空肠弯曲杆菌快速检测方法研究进展

申秋平 沈静怡 刘晓明 庄林林

摘要：空肠弯曲杆菌是一种常见的人畜共患病原菌，快速精准检测是有效控制其传播和感染的关键。本文主要介绍了近年来发表的快速检测空肠弯曲杆菌的相关方法，包括免疫学方法（酶联免疫吸附试验、免疫层析技术）、核酸检测方法（聚合酶链式反应及其衍生技术、多种等温扩增技术等），以及其他新型检测方法（表面等离子共振技术、生物传感器、CRISPR-Cas12b检测系统）。此外，本文还讨论了这些方法的优缺点以及在实际应用中的考虑因素，以期为行业研究者提供相对全面的空肠弯曲杆菌检测方法参考和科学依据。

关键词：空肠弯曲杆菌；快速检测；免疫学方法；核酸检测方法；生物传感器

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）是一种常见的肠道致病菌，属于弯曲杆菌属，革兰氏染色阴性[1]。该菌多寄生于畜禽、宠物及野生动物，可通过污染的水、牛奶、禽制品等途径进行传播，其感染可引起家畜繁殖障碍、乳房炎、幼畜禽腹泻等。人类感染则可急性胃肠炎或食物中毒，并伴发关节炎等免疫性疾病[2]。

快速、精准地检测空肠弯曲杆菌是有效控制和预防该类食源性病原菌传播的关键。近年来，免疫学和核酸检测技术及交叉学科技术的发展为快速精准检测空肠弯曲杆菌提供了新的有力技术和工具支持。本文就近年来国内外在空肠弯曲杆菌快速检测方法上的研究进展做一综述。

1 免疫学检测方法

1.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种可用于检测抗原或抗体的免疫学技术。ELISA方法具有良好的灵敏度和特异性，且操作相对简单，目前已广泛应用于医学诊断、生物学研究等领域。楼宏强等[3]以OMP18的B细胞抗原表位多肽为包被抗原，建立了一种可快速检测空肠弯曲杆菌的ELISA方法。实验表明，当表位多肽在稀释度1：1000时，免疫反应性增高最明显。同时，该方法的特异性经空肠弯曲菌感染的血清样本验证。

1.2 免疫层析技术

免疫层析技术是一种广泛使用的免疫学检测技术，可用于现场检测目标物质。由于免疫层析技术设计简单、操作方便，目前已广泛应用于医疗诊断、兽医学、食品及环境检测等。Kawatsu等[4]利用制备的针对空肠弯曲菌15-kDa细胞表面蛋白的单克隆抗体，建立了一种免疫层析检测方法（Campy-ICA）。经86株空肠弯曲菌和26种非空肠弯曲杆菌验证，该方法具有良好的特异性，且对C. jejuni细胞悬浮液的检测限为1.8×104 CFU/mL。通过对222份粪便样本进行检测表明，与细菌培养结果相比，Campy-ICA的敏感性和特异性分别可达84.8%和100%。此外，Campy-ICA操作简单，能够在15分钟内检测出粪便提取物中的弯曲杆菌抗原，有望作为粪便培养的一种简单而快速的辅助手段，用于检测样本中的空肠弯曲杆菌。

磁珠具有独特的磁学性能和高比表面积，且形貌可控、易于修饰，在病原体快速检测中具有非常高的应用价值。为快速捕获家禽样品中的空肠弯曲菌，Poonlapdecha等[5]使用多克隆抗体功能化的铁纳米颗粒进行目标菌特异性捕获。在此基础上，利用PCR扩增hipO基因目标片段并结合侧向层析试纸进行产物检测。结果显示，该方法对纯培养物以及人工感染物中的空肠弯曲杆菌检测限分别为1 CFU/mL和101～102 CFU/mL。此外，经60份鸡肉样本验证，该方法的相对准确性、特异性和敏感性分别可达96.67%、100%和93.33%。同时，该方法约可在3 h内完成检测，其结果与标准培养法相当，而后者需要5～7 d，显示出良好的临床检测适用性。He等[6]使用免疫磁性纳米球捕获、分离C. jejuni后，再用荧光量子点进行检测。该方法检测限为103 CFU/mL，线性范围为105～107 CFU/mL。与传统的方法如两步法、PCR或培养法相比，该策略不仅显示出增强的灵敏度，而且更简单、省时。

1.3 免疫学方法优缺点

ELISA、免疫层析技术以及免疫磁珠技术是目前已发表的可用于检测C. jejuni的主要免疫学技术。ELISA是一种常用的免疫学检测技术，方法设计灵活，应用范围广，但是需要制备抗原和抗体，以及相对较长的处理时间。免疫层析技术具有便携、快速和易于操作等优点，适于现场进行初步筛查，但其敏感性和特异性可能低于ELISA。免疫磁珠能快速、高效地富集目标病原体，可提高检测的灵敏度和特异性，但磁珠的制备需要特殊的设备和一定的技术要求。未来，随着科学技术的不断发展及多学科技术的融合，期待相关方法能在操作便捷性、灵敏度、特异性等方面能有更多的改良和提升，以更好地满足不同的场合和检测需求。

2 基于核酸的检测方法

2.1 基于聚合酶链式反应的检测方法

1）常规聚合酶链式反应。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）可通过在反应管内循环热解和合成来扩增特定的DNA片段，从而获得大量的DNA产物，具有灵敏、特异、高效、设计灵活、应用范围广等优势。根据已发表的研究，可用于建立PCR方法的空肠弯曲杆菌靶基因主要有mapA、ceuE、hipO、gyrA、flaA基因，以及16S rRNA、23S rRNA等。Zhang等[7]基于空肠弯曲杆菌hipO基因特异性保守区域设计引物，建立了一种qPCR方法。该方法的检出限可达4.3 CFU/mL，经242例腹泻患者粪便标本验证，其比常规细菌培养更敏感。胡哲等[8]以空肠弯曲杆菌gyrA基因为扩增靶标，建立了一种可特异性检测C. jejuni的PCR方法。分析结果表明，该方法检测限为8 CFU/mL，且与非C. jejuni菌株无交叉反应性。通过对100份鸡肉样品进行检测对比，该PCR法检测结果与生化试验一致。

2）多重PCR方法。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）是一种允许同时在同一反应中扩增两个或更多的目标序列，具有检测效率高、成本可控、减少污染风险等优势。陈荀等[9]基于C. jejuni 16S rRNA和hipO基因建立了一种双重PCR方法。结果显示，该方法针对C. jejuni能扩增出699和366 bp两个片段，而大肠杆菌、沙门氏菌等其他多种细菌均无法扩增。同时，该方法检测限为2.4～16 CFU/mL，且可在27 h内完成。翟海华等[10]以mapA和hipO为靶基因建立了一种可快速检测C. jejuni的双重PCR方法。相比于普通PCR，该方法能更特异、准确地检测出C. jejuni，且与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等无交叉反应性。

3）套式PCR。套式PCR（nested PCR）是PCR的一种衍生技术，该技术的特点是使用两对引物和两次PCR反应来提高检测的特异性和灵敏度。高正琴等[11]基于flaA基因设计内、外引物，建立了一种可特异性检测C. jejuni的套式PCR方法。分析表明，该套式PCR的检测限低至10 CFU，且检测可在8 h内完成。通过对121份临床样品进行检测，该套式PCR检出31份阳性，与常规细菌分离培养法一致。

为了实现套式PCR一管式扩增，Wu等[12]针对C. jejuni的hippuricase基因设计了两对嵌套的PCR引物，建立了一种新型单管嵌套PCR（Single-tube nested PCR，STN-PCR）。通过优化嵌套引物的退火温度和工作浓度，扩增过程中可依次使用内外两对引物。STN-PCR的检测限可达3.6×101 CFU/mL，比常规PCR低2个数量级。

4）荧光定量PCR。荧光定量PCR（Quantitative fluorescence PCR，qPCR）是一种在PCR过程中监测目标DNA扩增的实时方法，通过使用荧光染料或探针来检测特定的DNA序列。其中，染料法操作简便、成本低，而探针法更加特异且具有多重检测功能。

荧光染料可以结合到任何的双链DNA上，并在结合后产生荧光。在PCR过程中，随着DNA的扩增，荧光信号也随之增强。王大勇等[13]利用膜吸附-洗脱法富集环境水样中的空肠弯曲杆菌，并基于空肠弯曲杆菌VS1基因建立了一种qPCR方法，该方法检测限可达46 CFU/mL，线性范围为2.66×109～2.66×100 copies/μL，且与肠炎沙门氏菌无交叉反应。经实际水样检测验证，该方法检测结果与常规生化鉴定方法一致。张凤荣等[14]基于空肠弯曲杆菌mapA基因建立了一种qPCR方法，该方法检测限为6.42 copies/μL，并能特异性检测空肠弯曲杆菌，并具有良好的可重复性（组内和组间Ct值变异系数均小于2.5%）。

探针法主要是使用了特定的荧光标记探针，这些探针可以特异性地结合到目标DNA序列上。在PCR过程中，当探针与目标DNA结合时，会发出荧光信号。这种方法具有高度的特异性，但成本相对较高。阳成波等[15]建立的qPCR方法可在1 h内完成，检测限可达5 CFU，标准曲线相关系数为0.988。赵勤英等[16]以空肠弯曲杆菌hipO基因为靶标，建立的qPCR方法检测限可达15 CFU/mL，低于常规分离培养法和PCR法。此外，由于闭管式检测，可有效避免扩增产物引起的气溶胶污染和假阳性问题。李丹丹等[17]基于ORF-C基因设计引物及探针建立的qPCR方法可特异性检测C. jejuni，且检测限为11 CFU/mL。经60份样品检测验证，该方法检测结果与国标法一致，显示出良好的应用价值。

为实现一步法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌和空肠弯曲杆菌，温和心等[18]基于上述目标菌YST和VSI基因分别设计引物和探针，建立了一种双重qPCR方法。该方法对两种细菌的检测限均低于10 CFU/g，且具有良好的选择性和可重复性（批内和批间变异系数均小于1%）。此外，为了实现活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态的C. jejuni检测，Lv等[19]将叠氮溴化丙锭（PMA）与qPCR相结合，建立了一种PMA-qPCR方法。该方法针对细菌纯培养物的检测限为2.43 log CFU/mL。在3.43～8.43 log CFU/mL的线性范围内，相关系数为0.9999。

5）基于PCR的其他方法。PCR-ELISA是结合了PCR和ELISA两种技术的生物检测方法。首先通过PCR扩增目标DNA，然后使用ELISA技术对扩增产物进行快速检测和定量。唐梦君等[20]使用标记生物素和地高辛分别标记引物和探针，建立了一种可快速检测空肠弯曲杆菌的PCR-ELISA方法。该方法针对空肠弯曲杆菌基因组DNA和人工感染泄殖腔样本的检测限分别为2 fg、50 CFU/mL。经100份临床样品检测验证，该PCR-EIISA方法的阳性检出率（69%）高于常规PCR（60%）。

MPN（most probable number）法，即最近似数法，是微生物检验中常用以估算细菌浓度的一种方法。MPN法适于生长条件特殊的微生物定量、灵敏度较高，但常需进行生化鉴定，且操作烦琐、周期较长。有鉴于此，韩梅[21]基于空肠弯曲杆菌hipO基因和产气荚膜梭菌cpa基因设计PCR引物，联合MPN建立了MPN-PCR方法以快速检测上述两种目标菌。该方法不仅可以进行定量检测，还可准确检测VBNC状态的细菌。通过对186份鸡肉样品进行检测，空肠弯曲杆菌的阳性率为17.2%，含菌量范围为3.6～92 MPN/g。结果表明，该MPN-PCR方法具有特异性强、敏感性高等优点，为禽空肠弯曲杆菌精准检测提供了新的技术支持。

2.2 核酸等温扩增方法

1）环介导等温扩增。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是由Notomi等于2000年提出的一种核酸快速扩增技术。该技术可在恒温（60～65 ℃）条件下短时间内（通常1 h内）扩增出大量的目标序列，目前已广泛应用于病原体检测、遗传疾病诊断、食品安全检测和环境监测等领域。唐梦君等[22]基于gyrA基因设计引物建立了一种LAMP法以快速检测空肠弯曲杆菌。经实验验证，该方法可在45 min内完成扩增，与李斯特氏菌等8株菌株无交叉反应性，且对C. jejuni纯培养物的检测限为20 CFU/mL。齐诗蕊等[23]建立了一种靶向空肠弯曲杆菌hipO基因的LAMP方法，检测结果可通过实时浊度仪和裸眼显色两种方法进行判断。该方法可在62 ℃、60 min内完成扩增，且最低检出限为6.97×102 copies/μL，比常规PCR法低1个数量级。基于同样的靶基因，Liu等[24]建立的LAMP方法针对细菌培养和人工感染鸡肉的检测限分别低至34.2 fg/μL和103 CFU/g，敏感性与Jainonthee等[25]建立的实时LAMP方法相当。经74株细菌验证，该方法可特异性检测C. jejuni，而与大肠杆菌、海鸥弯曲杆菌以及其他11个属的食源性病原菌无交叉反应性。进一步地，徐义刚等[26]基于空肠弯曲杆菌ORF-C基因建立的LAMP法对纯培养菌的检测灵敏度达6 CFU/反应，显示出良好的实用性，为快速、特异检测空肠弯曲杆菌提供了有力工具支持。

进一步地，为实现快速、可视化检测空肠弯曲杆菌，Li等[27]开发了一种免疫捕获磁珠-增强LAMP-CRISPR/Cas12a方法（ICB-LAMP-CRISPR/Cas12a）。首先用ICB捕获空肠杆菌，LAMP扩增后产物使用CRISPR/Cas12a系统进行检测。该方法可在70 min内检测出低至8 CFU/mL的空肠弯曲杆菌。除ICB捕获外，整个反应过程在封闭管中进行，可有效避免气溶胶污染。同时，经不同养殖场的31份阳性粪便样品验证，该方法可准确检测出空肠弯曲杆菌。此外，为实现多重检测，盘宝进等[28]在环介导恒温扩增体系引入分子信标，建立了一种双重荧光LAMP方法以快速检测空肠弯曲杆菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。实验结果表明，该方法针对空肠弯曲杆菌的检测限为102 CFU/mL，且具有高特异性。

2）重组酶聚合酶检测方法。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种可在恒温条件下进行DNA扩增的新型技术，其主要依赖于三种酶，包括重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶，目前已被发展用于多种病原体的分子检测。Geng等[29]基于hipO基因建立一种实时RPA检测方法以实现对空肠弯曲杆菌的快速高效检测。分析表明，该方法可在约13 min内检测出102 copies/μL的细菌DNA，敏感性与qPCR方法相当，且具有良好的特异性。

为实现现场检测C. jejuni，Chen等[30]整合纸基DNA提取、RPA和侧向层析技术，构建了一种混合微流控装置。RPA反应在20 min内完成，并对C. jejuni显示出100%的特异性。该微流控装置的检测限为460 CFU/mL。该装置将核酸提取从密集的移液简化为纸质试样，使其更便于在现场使用，为监测C. jejuni疫情提供了新的有力工具支持。

3）依赖核酸序列的扩增。依赖核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是一种用于扩增RNA序列的分子生物学技术。该技术利用逆转录酶、RNA多聚酶以及核糖核酸酶循环复制和转录靶RNA，以实现RNA快速、准确地扩增。Churruca等[31]针对空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的16S rRNA设计了一套特异性引物和信标探针，建立了一种基于分子信标的NASBA方法以实时检测鸡肉样品中的两种目标菌。整个反应在封闭试管中进行，可有效降低污染风险。结果表明，该方法可有效检测缓冲盐水和人工污染鸡肉样品中的目标菌，且比常规NASBA和Northern印迹更方便。此外，实验证明，该方法可特异性检测新鲜或饥饿培养细菌样品中的空肠弯曲杆菌以及VBNC状态的空肠弯曲杆菌，而热失活的细菌样品中则未检测到rRNA信号。

2.3 核酸检测方法的优缺点

PCR是目前最常用的核酸检测技术，其优点在于高度敏感和特异，且方法设计灵活。然而，其结果判断主要依赖琼脂糖凝胶电泳，需使用存在安全威胁的核酸染料。多重PCR可同时检测多个目标序列，有效提高了PCR的检测效率，但需注意引物之间的相互干扰及反应体系的和条件的优化。套式PCR通过两轮PCR大大提高了检测的灵敏度和特异性，但也增加了样本污染的风险。qPCR可实现实时定量检测，不需要后续的凝胶电泳步骤，具有检测速度快、灵敏、特异等优势。然而，这类方法需要专用的设备和荧光探针，成本相对较高。PCR-ELISA通过结合PCR和ELISA，可以对特定的PCR产物进行检测和定量，但操作步骤复杂，可能存在误判的风险。LAMP方法扩增DNA效率高、反应设备简单。然而，其特异性可能低于PCR。RPA检测时间短，适于现场快速检测，但其对引物和模板的设计要求较高。NASBA可用于扩增RNA，且具有较高的敏感性和特异性，但反应体系复杂，在DNA检测中不具优势。

3 其他新型检测方法

3.1 表面等离子共振技术

表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）是一种利用表面等离子体共振现象来研究分子间相互作用的技术。Singh等[32]使用空肠弯曲菌噬菌体NCTC 12673受体结合蛋白功能化的捕获表面来特异性地捕获C. jejuni，并将谷胱甘肽自组装单层（GSH SAM）固定在SPR表面。分析表明，基于GSH SAM的细菌捕获效率比基于DTSP自组装单层的无定向附着提高了2～3倍。同时，该方法可检测到低至102 CFU/mL的空肠弯曲菌，且具有高选择性。Masdor等[33]联合SPR和扣除抑制试验（subtractive inhibition assay，SIA）建立了一种SIA-SPR方法以快速检测C. jejuni。将特异性兔多克隆抗体与C. jejuni细胞混合后，使用芯片修饰山羊抗兔IgG多克隆抗体的SPR传感器进行检测。该SIA-SPR方法对C. jejuni的检测极限为131±4 CFU/mL，且具有很高的特异性。

3.2 生物传感器

为快速检测食品中的空肠弯曲杆菌，Masdor等[34]利用兔多克隆抗体作为捕获抗体，构建夹心法石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）免疫传感器，并与金纳米颗粒（AuNPs）共轭作为检测抗体。该传感器检测限低至150 CFU/mL，具有良好的临床检测应用价值。Wang等[35]在QCM基础上，使用纳米级磁珠（Magnetic nanobeads）分离目标病原体，并使用AuNPs进行检测信号放大。用QCM分析仪测量共振频率，并将共振频率的变化与空肠杆菌的细胞数相关联。结果表明，该QCM免疫传感器检测限为20～30 CFU/mL，且无需预富集，总检测时间小于30 min。

Kim等[36]使用适配体功能化的金纳米颗粒构建了一种新型比色传感器以实现空肠弯曲杆菌现场检测。在高特异性适配体的作用下，金纳米颗粒的聚集将产生明显地从红色到紫色的颜色变化。经50份自然污染的禽样本的验证，该传感器的检测准确率优于基于琼脂的常规分离培养法，且可将样品富集后的检测时间从48 h缩短至30 min。

Dehghani等[37]基于多克隆抗体与石墨烯量子点在C. jejuni细胞膜上与表面蛋白的相互作用，构建了一种荧光免疫传感器。石墨烯量子点与C. jejuni的特异性结合导致石墨烯量子点和氧化石墨烯之间产生距离，产生荧光。当缺乏C. jejuni或存在其他细菌细胞的情况下，石墨烯点和氧化石墨烯之间的距离非常低，荧光关闭。实验表明，C. jejuni的逐步增加导致荧光发射逐渐增加，并且该过程是线性的。该传感器可在1.5 h内完成检测，检测限为10 CFU/mL，并具有良好的特异性。

3.3 其他新型方法

近年来，RNA引导的CRISPR-Cas方法由于其高可靠性和特异性，在快速核酸检测方面显示出具有吸引力的应用前景。Cas12b是一种双RNA引导的DNA核酸内切酶，在被sgRNA靶标复合物激活后显示出侧支切割活性。在此过程中，Cas12b可在单碱基水平识别复合物并切割其周围的非靶点单链DNA。Huang等[38]开发了一种基于CRISPR-Cas12b的系统来快速准确地检测C. jejuni。该系统可识别C. jejuni特异性和保守基因组。该系统可在约40 min内检测出约10 CFU的C. jejuni，低于传统的分离方法，且具有高特异性。

3.4 新型检测方法的优缺点

SPR具有非破坏性、灵敏度高、快速响应、适用范围广等优点，但该方法需要较高要求的实验室技术和设备。生物传感器优点是灵敏度高、检测速度快，但目前传感器的设计和制备要求较高。随着生物、物理、化学等多学科的融合创新，期待上述新型检测方法在方法设计、设备制作、检测成本等方面能有更多的突破。

4 总结

近年来，免疫学技术、核酸检测技术及新兴交叉学科技术在空肠弯曲杆菌快速检测及应用中均取得了显著的进展。目前，这些技术各有优、缺点，例如：免疫学方法操作简单、快速，但需考虑交叉反应的影响；基于PCR的方法灵敏度高，但需要专业的设备和训练；核酸等温扩增技术支持现场即时检测，但在方法成熟度以及稳定性方面仍有待提升；表面等离子共振、生物传感器等可实现超敏检测，但较高的检测成本、样本处理及结果分析要求等仍限制着这些技术的推广应用。

随着交叉学科的技术融合与创新，期待能有更多简单、快速、超敏、特异、可视化的空肠弯曲杆菌检测方法，以更好地满足人类及动物健康等多层次、多样化的现实需求。

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