大肠菌群冷水凝胶快速检测试纸片的研发

贾振华等

摘要：对检测食品中大肠菌群快速检测纸片法进行研究。结果表明，经过对培养基中显色剂和冷水凝胶成分的优化，培养基中氯化三苯四氮唑的浓度为0.4 mg/L时，试纸片显色效果最好，形成的菌落数较多；同时研究冷水凝胶对大肠菌群生长的影响，当冷水凝胶浓度高于或低于0.7%时，大肠菌群生长速度减慢。采用国标法和纸片法检测市售的8种食品，本试纸片法与国家标准方法检测结果一致，纸片法的特异性和重复性较好。

关键词： 大肠菌群；快速检测；试纸片

中图分类号：Q93-332 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4281-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.045

随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。其中，大肠菌群检测结果是判断食品是否安全的重要指标之一。大肠菌群并不是指某一特定细菌的名称，而是对一大类细菌的概括名称。它被定义为一群在37 ℃、24 h能发酵乳糖、产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢的小杆菌[1]。它主要来源于人畜粪便，作为食品、水、药品及化妆品等被粪便污染的标志，已成为卫生细菌学的必检项目。

目前，对于食品中大肠菌群的检测大多采用国标法，国标法检测结果的准确性、灵敏性均较高，但操作繁杂、耗时较长，不适用于快速检测，对检测人员业务水平要求也较高，同时不便于现场快速检测。目前检测大肠菌群较为先进的方法有酶化学法、生物发光法、分子生物学方法和免疫学方法等[3]。上述方法已被广泛应用，但也存在如滞后性严重、仪器成本高、专业要求高等不足。食品中大肠菌群的检测要求准确度高，及时性强，因此急需操作简单、快捷的检测方法。而纸片法简便易行，省去了繁琐的操作流程。当待检样品较多时，选择该法较合适，尤其是食品安全突发事件时，可在短时间内迅速对样本进行检测，判断样本是否被大肠菌群污染。

本研究以滤纸片作为培养基和冷水凝胶的载体。培养基中含有氯化三苯四氮唑（TTC），在大肠菌群脱氢酶的作用下，TTC接受氢生成红色而不溶于水的三苯甲胺使菌落呈现红色；同时，培养基中还添加了乳糖和酸碱指示剂，大肠菌群能分解乳糖产酸而使酸碱指示剂变色，菌落周围产生黄圈。针对影响大肠菌群测试片质量的多种因素开展研究，旨在研制快速简便、特异性强、准确度高、重复性好的测试片。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单增李斯特菌CMCC（B）54002-5、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志贺菌CMCC6120513、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，均购于广东省微生物研究所。

1.1.2 试剂 培养基配方：每升培养基中含胰蛋白胨15.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化纳5.0 g、磷酸氢二钾5.0 g、乳糖15.0 g，pH 6.3～6.5；冷水凝胶配方：质量体积比为0.2%～0.4%聚丙烯酸钠、0.1%～0.3%黄原胶、0.1%～0.2%卡拉胶和0.1%～0.2%魔芋胶；滤纸片为薄层层析滤纸。

1.1.3 检测样品来源 从武汉市部分超市、农贸市场采集或购买样品（牛奶、大白菜、蛋糕、啤酒、果汁、蜂蜜、卤牛肉）共7份。

1.1.4 仪器设备 智能恒温恒湿箱（Hst-250）。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制 将培养基和冷水凝胶加入到去离子水中，定容至1 000 mL，在121 ℃灭菌15 min，再加入1.25 mL浓度为1 mg/mL脱氧胆酸钠、8 mL 1.6%溴甲酚紫溶液、5 mL 0.8% TTC溶液，混匀后备用。

1.2.2 样品制备 在无菌条件下，将25 g/mL样品（固体样品粉碎），放入装有225 mL无菌生理盐水和适量玻璃珠的500 mL烧杯中，经充分振摇，依次无菌稀释成10-1、10-2、10-3稀释液。

1.2.3 纸片法制备 筛选白色、无毒、中速、密度均匀、吸附力合格的滤纸，将滤纸裁剪成合适的尺寸，通常为5.0 cm×5.0 cm。将滤纸片于121 ℃灭菌15 min。用无菌镊子夹取滤纸浸泡在上述制备的培养基中浸泡2 h，拿出平放于托盘中，37 ℃烘干。分装于已灭菌的聚丙烯塑料口袋内，密封备用。

1.2.4 样品检测 采用无菌操作将制备的样品稀释液取1 mL分别涂布于纸片上，每个稀释液涂布 3个，将涂布好的纸片放入无菌袋，置于培养箱中37 ℃，培养14～16 h。结果判定：纸片上出现红色菌落，其周围有黄圈者为阳性，根据测试上的红色菌落数可以计算大肠菌群的浓度。

1.2.5 比对试验 采用大肠菌群国家标准检测方法GB 4789.3-2010 与纸片法结果进行比对。

2 结果与分析

2.1 纸片法检测大肠埃希菌结果

将大肠埃希氏菌ATCC25922过夜培养，将1mL菌悬液8 000 r/min离心5 min，将菌体重悬于1 mL无菌水中，按照10倍稀释，稀释到10-6后，将1 mL菌悬液或无菌生理盐水滴加至纸片法上，36 ℃±1 ℃培养16～24 h，观察纸片上菌落的生长情况。在纸片法上呈均匀紫蓝色者为阴性（图1A），纸片上出现红色斑点，外周黄晕或纸片产生黄色背景者为阳性纸片（图1B）。

2.2 TTC浓度对试纸片检测结果的影响

不同浓度TTC用量下，大肠埃希氏菌ATCC25922菌悬液培养后计数结果如图2所示。由图2可知，当TTC浓度为0.4 mg/L时，菌悬液形成菌落清晰，其生长呈现最好状态，即红色菌落数目最多。在TTC的量大于或小于0.4 mg/L时，所生成的红色菌落逐渐减少。

2.3 冷水凝胶对检测结果的影响

在培养基中加入可以替代琼脂的冷水凝胶，规避了琼脂在低温下容易凝固的不足，同时，也使纸片法质地更为紧密均匀。如图3所示，在培养基中加入不同量的冷水凝胶后，菌落形成出现较大变化。当每100 mL培养基中加入0.7 g冷水凝胶时菌落生长最好。用量超过0.7 g时，菌落数相对减少。

2.4 国标法与纸片法法检验比对

采用平板计数法和测试法分别检测市售菠菜、牛奶、大白菜、卤牛肉、蛋糕、果汁、猪肉7种样品，检测结果见表1。由表1可知，国标法与纸片法检测结果基本一致。

2.5 检测特异性试验

分别将大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单增李斯特菌CMCC（B）54002-5、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志贺菌CMCC6120513、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028过夜培养，培养物用灭菌生理盐水作10倍递增稀释，取合适稀释度（一般10-5～10-7为宜）分别接种于测试片，每片各1 mL，设3次重复；同时接种乳糖胆盐发酵管3支，每支1 mL，设3次重复。将上述测试片和发酵管置37 ℃培养 18～24 h。大肠埃希氏菌ATCC259221培养 24 h后产酸产气，判定为大肠菌群阳性；采用纸片法培养16 h，大肠埃希氏菌ATCC2592211出现红色斑点，其周围变黄或整张纸片变黄，按标准判定为大肠菌群阳性。而其他5株 （金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌、鼠伤寒沙门氏菌）在纸片法均不变黄，也无红色斑点，按标准判定为大肠菌群阴性。纸片法检测结果与发酵法完全一致，说明纸片法特异性与经典的发酵法相一致。

2.6 重复性试验

纸片法重复性试验结果由表2中可知，在牛奶中添加不同浓度的大肠菌群，纸片法5次检测结果与九管发酵法一致，表明本纸片法重复性较好。

3 小结与讨论

大肠群菌作为人、畜粪便污染指标而成为食品和餐（饮）具卫生学评价的重要指标，常采用传统的发酵法检验。但传统发酵法操作繁琐，费时费力，不利于食品和餐（饮）具的日常检测和监督管理[4-7]。可采用纸片法取代发酵法，两法的检测结果基本一致，而纸片法具有简便、快速、省时、省力等优点。

纸片法在快速检验食品中大肠菌群有较好的效果，但食品成分比水要复杂的多，细菌相的组成也比较复杂，影响因素也多，因此下阶段要进一步深入对营养液配方的研究，使纸片法适合大部分食品的检测需求，或者根据不同类别的食品研制专用检测纸片。

参考文献：

[1] 潘慧华，李晶晶，刘坚真.大肠菌群一步发酵法检测的研究[J].食品科学，2007，27（12）：637-641.

[2] GB 4789.3-2010，食品安全国家标准[S].

[3] 吕肖楠.大肠菌群快速检测方法的研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2014.

[4] 孙京新，李晓峰，于海峰，等.肉品中菌落总数和大肠菌群快速检测试纸片的研究[J].肉类工业，2009（7）：23-26.

[5] 唐漪灵.Petrifilm纸片法和国标法检测奶制品细菌总数和大肠菌群数的结果比较[J].中国卫生检验杂志，2000，10（3）：326-327.

[6] 邢业兰，张维华.食品用TTC纸片测定饮水大肠菌群初探[J].中国卫生检验，1998，8（5）：291-293.

[7] 井良义，杨艳丽，刘 军.大肠菌群快检纸片质量鉴定标准研究[J].中国公共卫生，2002，18（1）：98-99.