香薷空气清新剂的制备工艺及抑菌效果评价

李海燕 范彬 白雯静 尹盼盼 彭腾腾 石晓峰

【摘 要】   目的： 以“药食兼用”的香薷为主要原料，研究中药香薷挥发油空气清新剂的制备工艺，以期为后续香薷防瘟疫系列产品的注册和工业化生产提供实验室依据。 方法： 以金黄色葡萄球菌为试验菌，抑菌圈直径为评价指标，采用纸片抑菌试验方法结合析因设计筛选空气清新剂最佳制备工艺，通过试管二倍稀释法测定香薷空气清新剂的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。 结果： 精油含量和含醇量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果具有显著性影响（ P＜ 0.05），两因素间交互作用不明显，经析因设计确定香薷空气清新剂最佳制备工艺：香薷精油与雪松精油的配比为8∶ 2，精油与吐温-80的配比为1∶ 4，精油含量为6%、含醇量为40%。制得的香薷空气清新剂对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为  7.81 μL/mL ，最低杀菌浓度为62.5 μL/mL。 结论： 本实验制得了一种抑菌效果良好的中药空气清新剂。

【关键词】  香薷精油；空气清新剂；纸片抑菌试验；析因设计

【中图分类号】R285

【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）08-0044-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.08.zgmzmjyyzz202408010

Preparation Technology and Antibacterial Effect Evaluation of Mosla Chinensis Air Freshener

LI Haiyan  1，2  FAN Bin 2 BAI Wenjing 3 YIN Panpan  1，2  PENG Tengteng  1，2  SHI Xiaofeng  1，2，3*

1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China;

2. Gansu Academy of Medical Sciences， Lanzhou 730000， China;

3. Lanzhou Institute of Food and Drug Control， Lanzhou 730000， China

Abstract：

Objective  To study the preparation technology of Mosla chinensis essential oil air freshener with “medicinal and edible” Mosla Chinensis as the main raw material， in order to provide laboratory basis for the subsequent registration and industrial production of Mosla Chinensis pestilence prevention series products.  Methods  Using S. aureus as test bacteria and the diameter of inhibition zone as evaluation index， the paper antibacterial test method combined with factorial design was used to screen the optimal preparation process of air freshener. The minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of Elsa chinensis air freshener were determined by tube double dilution method.  Results  The content of essential oil and alcohol had a significant effect on the antibacterial effect of S. aureus （ P＜ 0.05）， and the interaction between the two factors was not obvious. The optimal preparation process of Elsuch air freshener was determined by factorial design： The ratio of Elmosla essential oil to cedar essential oil is 8∶ 2， the ratio of essential oil to Tween-80 is 1∶ 4， the content of essential oil is 6%， and the content of alcohol is 40%. The minimum inhibitory concentration of the prepared Eltzla chinensis air freshener against S. aureus was 7.81 μL/mL， and the minimum bactericidal concentration was 62.5 μL/mL.  Conclusion  A Chinese medicine air freshener with good antibacterial effect was prepared in this experiment.

Key words：

Elsholtzia Essential Oil;Air Freshener;Disk Antibacterial Test;Factorial Design

中药空气清新剂一般选用富含挥发油和具有广谱抗菌、抗病毒功效的中药材作为原料  ［1］ ，或选用药食两用药材组成的中药组方制成。依中药空气清新剂的外观形态可分为固体、液体和气雾型三种，其安全性高，用途广泛，可用于清新空气、环境消毒、预防疾病、驱蚊、防止晕车等。香薷作为常用的芳香中药，挥发油是其主要的药效成分，现代研究  ［2-4］ 发现，香薷挥发油有良好的广谱抗菌抗病毒作用，可作为抗菌防疫产品的原料，此外，还具有消炎解热、镇静止痛和调节免疫等功效。故本实验选择以香薷挥发油为主要原料，旨在研发气味清香、空气消毒效果良好的中药空气清新剂，为后续的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 详见表1。

1.1.2实验仪器 详见表2。

1.1.3 供试菌 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC （B） 26 003］，购买于中国食品药品检定研究院， 并定期采用国标的鉴定方法进行鉴定和确认。

1.2 实验方法

1.2.1 香薷空气清新剂的制备 如图1所示。

1.2.2 抑菌试验

1.2.2.1 培养基的制备 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）：加蒸馏水煮沸溶解，pH为（7.3±0.2），121 ℃高压灭菌15 min， 备用。营养肉汤培养基：加蒸馏水煮沸溶解，pH为（7.5±0.2），分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

1.2.2.2 菌悬液的制备 取金黄色葡萄球菌菌株保藏斜面，将斜面培养物用无菌生理盐水洗下，并稀释至5.0×10 5 ～5.0×10 6 CFU/mL备用。

1.2.2.3 纸片抑菌试验 用打孔器制备直径6 mm的定性滤纸片，经高压灭菌器灭菌后，置于160 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干。取干燥的无菌滤纸片，每片滴加10 μL精油/香薷混合液，将该含药滤纸片平放于无菌平皿内，置室温下自然干燥后备用。

按《中华人民共和国卫生行业标准》（WS/T 650-2019）  ［5］ 的要求，在生物安全柜中移取金黄色葡萄球菌菌悬液100 μL于胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上，用L棒涂布均匀，使菌悬液均匀分布到TSA平板的表面，静置5 min，待菌液完全被平板吸收后，用无菌敷料镊取含药滤纸片贴放于平板表面，每个平板贴放4片试验样片（各样片中心之间相距25 mm以上，与平板的周缘相距  15 mm  以上），1片阴性对照样片（置于平板中心）。并用无菌敷料镊轻压样片，使其紧贴于平板表面后，盖好平皿，置于36 ℃恒温培养箱培养24 h，观察结果。平行3次试验，用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录，取平均值作为最终试验结果。

根据上述标准进行结果判定：阴性对照样片应无抑菌环产生，试验样品抑菌环直径＞7 mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径≤7 mm者，判为无抑菌作用。

1.2.3 香薷精油与雪松精油配比的筛选 将香薷精油和雪松精油以9∶ 1、8∶ 2、7∶ 3、6∶ 4（v/v）的比例进行复配，通过纸片抑菌试验，以抑菌圈直径为评价指标，考察不同配比下的香薷精油与雪松精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，确定香薷精油和雪松精油的最佳配比。

1.2.4 香薷、雪松混合精油与吐温-80配比的筛选 取一定量混合精油6份，将其与吐温-80以 1∶ 1 、1∶ 2、1∶ 3、1∶ 4、1∶ 5、1∶ 6（v/v）的比例混匀，加适量无水乙醇后，再加蒸馏水至总量混匀，观察药液外观形态，确定香薷、雪松混合精油与吐温-80的最佳配比。

1.2.5 析因设计结合纸片抑菌试验确定香薷空气清新剂最佳配方

1.2.5.1 单因素试验 通过预实验发现精油含量和含醇量是影响香薷空气清新剂抑菌性的的最主要因素，采用纸片抑菌试验，以金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小为评价指标，选取精油含量和含醇量进行单因素试验。

1.2.5.1.1 精油含量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 结合预实验结果，固定含醇量为40%，以抑菌圈直径为评价指标，考察精油含量为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%时的香薷混合液对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果。

1.2.5.1.2 含醇量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 固定精油含量为6%，以抑菌圈直径为评价指标，考察含醇量为 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%时的香薷混合液对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果。

1.2.5.2 析因设计 根据单因素试验结果，A因素（精油含量）设 2水平，B因素（含醇量）设4水平。见表3。根据2×4析因设计法制备8种香薷空气清新剂（表4），通过纸片抑菌试验，比较各组对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

1.2.6 香薷空气清新剂最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定

1.2.6.1 香薷空气清新剂最低抑菌浓度（MIC）的测定 采用试管二倍稀释法，用无菌营养肉汤液体培养基对香薷空气清新剂进行倍比稀释，使香薷空气清新剂浓度分别为500 μL/mL、250 μL/mL、125 μL/mL、62.5 μL/mL、31.25 μL/mL、15.63 μL/mL、7.81 μL/mL、3.91 μL/mL、1.95 μL/mL、0.98 μL/mL、0.49 μL/mL、0.25 μL/mL。按无菌操作要求，向各试管中分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液0.1 mL，并设置阳性对照管（含菌悬液及液体培养基，不含药液）、培养基对照管（只含液体培养基）、空白药液-阴性对照管（只含药液）。将各试管放在36 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察细菌的生长情况。

结果判断：在阳性对照管细菌呈浑浊状生长，培养基对照管、药液对照管无细菌生长且呈透明状的前提下，观察不同浓度香薷空气清新剂试管的浑浊情况，以细菌不生长（肉眼观察试管为透明状）的最低浓度为香薷空气清新剂的最低抑菌浓度。

1.2.6.2 香薷空气清新剂最低杀菌浓度（MBC）的测定 在“1.2.6.1”试验的基础上，从无菌生长的营养肉汤液体培养基试管中吸取200 μL混和液，涂布于TSA平板上，置于36 ℃恒温培养24 h，观察是否有菌生长，以无菌生长的最小浓度为香薷空气清新剂的最低杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 确定香薷精油与雪松精油的最佳配比 通过考察香薷精油与雪松精油在4种不同配比（9∶ 1、8∶ 2、7∶ 3、6∶ 4）下对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果，发现4种不同配比的香薷、雪松混合精油均对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用且抑菌效果相差不大，并且显示香薷精油：雪松精油为8∶ 2时抑菌效果好，抑菌圈直径达11.19 mm，其次考虑以香薷精油为主要原料，故确定香薷精油与雪松精油配比为8∶ 2。结果见表5。

2.2 确定香薷、雪松混合精油与吐温-80的最佳配比 本品是以精油为原料制成的空气清新剂，防止精油在制剂中溶解不充分，故加入乳化剂吐温-80。通过观察香薷、雪松混合精油与吐温-80在不同配比下的药液外观形态，发现当香薷、雪松混合精油：吐温-80为1∶ 4、1∶ 5、1∶ 6时可使药液澄清，按照药用辅料最小的药用原则，确定香薷、雪松混合精油与吐温-80的最佳配比为1∶ 4。结果见表6。

2.3 析因设计结合纸片抑菌试验确定香薷空气清新剂最佳配方

2.3.1 单因素试验结果

2.3.1.1 精油含量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 固定含醇量为40%，以抑菌圈直径为评价指标，通过考察精油含量为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%时的香薷混合液对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果，发现当精油含量大于3%时香薷混合液开始对金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用，并随精油含量的增加抑菌效果有所增加，且当精油含量为6%、7%时，抑菌效果较好，抑菌圈直径可达7.24 mm和7.52 mm。故选取精油含量为6%和7%的两个水平。结果见表7，如图2所示。

2.3.1.2 含醇量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 固定精油含量为6%，以抑菌圈直径为评价指标，通过考察含醇量为 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%时的香薷混合液对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果，发现香薷混合液对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果随含醇量的增加而有所增加（除含醇量在20%时无抑菌效果外，其余含醇量的香薷混合液均对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用），并且当含醇量≥40%时抑菌效果较明显，抑菌圈直径均大于8.00 mm，但各含醇量间的抑菌效果差别不大，考虑到乙醇作为溶剂的原因，故选取含醇量为35%、40%、45%、50%的4个水平。结果见表8，如图3所示。

2.3.2 析因设计结果 通过考察8种香薷空气清新剂对金黄色葡萄球菌的纸片抑菌效果，发现8种香薷空气清新剂均对金黄色葡萄球菌具有较好抑菌效果，并且其抑菌效果大小排序为A2B4＞A2B3＞A1B4＞A2B2＞A1B3＞A2B2＞A1B2＞A1B1。由SPSS两因素方差分析可知，在本实验范围内，精油含量（A）和含醇量（B）对金黄色葡萄球菌抑菌效果的影响都有统计学意义［ P＜ 0.05，P（A）为0.012，P（B）为0.007］。两因素间无明显交互作用（ P= 0.484＞0.05）。见表9。

综上及考虑到精油成本及乙醇用量安全性问题确定香薷空气清新剂最佳配方为A1B2（精油含量为6%，含醇量为40%）。

2.4 确定香薷空气清新剂的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC） 通过观察金黄色葡萄球菌在不同浓度香薷空气清新剂下的生长情况，发现香薷空气清新剂浓度为7.81 μL/mL时无细菌生长，浓度为3.91 μL/mL时细菌开始生长，故确定香薷空气清新剂对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为7.81 μL/mL。见表10；通过观察TSA平板上的细菌生长情况，发现当香薷空气清新剂的浓度为62.5 μL/mL时无细菌生长，浓度为  31.25 μL/mL  时细菌开始生长，故确定香薷空气清新剂对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为  62.5 μL/mL 。见表11。

2.5 确定香薷空气清新剂的最佳制备工艺 根据析因设计实验结果确定香薷空气清新剂制备工艺为：吸取一定量按8∶ 2配比的香薷、雪松混合精油，以精油与乳化剂吐温-80为1∶ 4的比例加入吐温-80，混匀，加入无水乙醇适量，混匀，再加蒸馏水使含醇量达40%，精油含量达6%，滴加适量薰衣草精油调香，分装，即得。

2.6 香薷空气清新剂的制备工艺验证 重复上述“2.5”项下香薷空气清新剂制备工艺，制备三批香薷空气清新剂，采用纸片抑菌试验考察其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。见表12，结果显示三批香薷空气清新剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较好，且纸片抑菌圈直径均大于9 mm，证明上述制备工艺可行，重复性好。

3 结论与讨论

本实验确定香薷空气清新剂的最佳制备工艺：香薷精油与雪松精油的配比比例为8∶ 2（v/v），精油与乳化剂吐温-80的加入比例为1∶ 4（v/v），精油含量为6%、含醇量为40%。确定香薷空气清新剂的最低抑菌浓度为7.81 μL/mL，最低杀菌浓度为62.5 μL/mL。本研究制备的空气清新剂具清新和抑菌双重功效，并且其安全性高、绿色环保，也无对衣物的药液染色现象，有很好的推广价值。

本实验结果中纸片抑菌实验结果不是很平行，考虑主要有三方面的原因：①用打孔器制备直径6 mm的定性滤纸片时，由于打孔器使纸片弯折等原因，各纸片直径大小会存在差异，对抑菌结果的测定会产生一定的影响；②由于精油稳定性的原因，对纸片抑菌结果会产生一定的影响；③用游标卡尺测量抑菌圈直径时存在人为的测量误差，导致结果存在一定的差异。

实验制得的香薷空气清新剂对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，但抑制程度不高，而从“2.3.1.2”项下结果可知醇浓度的增加会使该制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果增加，由于本实验将无水乙醇作为溶剂加入，故没有考虑将该制剂中的醇浓度加大，如果后期想让该制剂能有更好的抑菌效果，考虑将含醇量加大到75%可能会实现其抑菌效果的增强。

参考文献

［1］范张姣. 空气清新剂研究现状 ［J］. 科技信息，2012（2）：206.

［2］李知敏，王妹，彭亮. 江香薷挥发油的化学成分分析及其对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用 ［J］. 食品科学，2016，37（14）：138-143.

［3］刘梦婷，罗飞亚，曾建国. 石香薷精油成分分析及其抗菌抗氧化活性 ［J］. 中成药，2020，42（11）：3091-3095.

［4］刘静，黄鹤，陈殊，等. 石香薷挥发油抑菌和免疫应答作用 ［J］. 中南民族学院学报（自然科学版），1996（4）：54-57.

［5］中华人民共和国卫生行业标准. 抗菌和抑菌效果评价方法：WS/T 650—2019［S］. 北京：国家卫生健康委员会，2019.

（收稿日期：2023-07-29 编辑：刘 斌）