核桃叶片挥发性成分提取及其驱蚊活性的研究

王茹 杨梦思 张萍 孙雅丽 虎海防

摘要：为筛选具有较强持效性和驱蚊效果的核桃叶片提取物，利用超声辅助水蒸气蒸馏法提取‘温185‘山核桃‘美国东部黑核桃和‘实生核桃叶片挥发油，以核桃叶片挥发油提取率为指标，在单因素试验的基础上进行正交试验，得出核桃叶片挥发油的最佳提取条件，并结合驱蚊试验，以驱蚊率为指标，筛选4种核桃叶片提取物的最佳驱蚊含量水平。结果表明，超声辅助水蒸气蒸馏法提取‘美国东部黑核桃叶片挥发油的最佳提取条件为提取时间8 h，超声时间10 min，固液比1∶10（ g·mL-1）；在此条件下，核桃叶片挥发油的提取率为0.475%。以无水乙醇为溶剂将4种核桃叶片挥发油提取物溶液稀释为10%、20%、30%、40%并测定其溶液的驱蚊率，‘美国东部黑核桃叶片挥发油提取溶液在30%含量水平下驱蚊时间可达20 min，此时驱蚊率为85.18%，驱蚊效果最佳。‘美国东部黑核桃叶片挥发油提取物溶液具有良好的驱蚊效果，具有开发为植物源驱避剂的潜力，可进一步推广应用。

关键词：核桃叶片；最佳提取条件；活性成分；驱蚊效果

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0448

中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：1008‐0864（2024）03‐0223‐11

蚊虫是重要的病媒之一，不仅传播疟疾、黄热病、登革热等传染病，而且严重威胁人类健康[1]。使用化学杀虫剂防治是控制蚊虫危害的重要措施。目前市场上使用的蚊虫驱避剂主要是化学合成的避蚊胺（N， N-diethyl-3-methyl benzoyl amide，DEET），因其良好的驱蚊作用而被广泛地用作驱虫剂，但DEET有毒，对皮肤有刺激作用。化学杀虫剂的大量、长期使用易引起蚊虫抗药性并对环境造成污染，所以研发安全有效、低毒无副作用的驱蚊剂，已成为研究热点[2]。近年来，国内外学者致力于研究天然杀虫成分和植物源的天然驱避剂代替杀虫剂。从植物中提取的挥发性化合物[3‐4]是重要的次生代谢物，是从叶片和植株表层释放出来的挥发性化学成分，其所含的柠檬烯、石竹烯、α-蒎烯、香叶醇和芳樟醇均有驱蚊效果[5-9]。有学者利用高效液相层析法（high performance liquidchromatography，HPLC）、气相色谱-质谱联用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）等手段对植物挥发性物质进行分析研究，取得了重大突破。杨中林[10]采用GC-MS分析山鸡椒油、薄荷油和月桂油的主要组成成分有肉桂烯、萜品油烯、D-柠檬烯等，并获得对人体驱蚊效果较好的配方制剂，可作为植物源驱避剂。林琳[11]对侧柏、孔雀草、薄荷、驱蚊香草、番茄等不同种类驱蚊材料的驱蚊效果进行了测试，发现5种植物都有一定的驱蚊作用，随时间的推移驱蚊效果逐渐减弱。Tunón等[12]发现青蒿中的香豆素和侧柏醇可作为驱蚊物质。植物源驱虫剂作为一种天然产品，对环境无害，因此利用植物衍生资源产品开发驱虫剂，已经成为目前的研究热点。但是，从天然驱避剂中研制出一种可以取代DEET的高效、广谱的驱虫剂，仍然存在着许多问题[13]。比如，在开发的过程中，如何兼顾植物资源的保护，如何利用植物资源，是否对环境产生影响，是否破坏生态平衡，以及能否推广到工业化生产中，这些问题都要慎重考虑[14]。而在当前的人工合成驱避剂中，尚无性能较好、毒性较低、环境友好的驱避剂。本研究利用超声波辅助水蒸气蒸馏提取方法，分别对‘美国东部黑核桃（J. nigra）、‘ 温185（J. regiaWenl85）、‘实生核桃（J. regia Shisheng）及‘山核桃（C. cathayensis）进行有效成分的提取，结合驱蚊试验，筛选4种核桃叶片提取物的最佳驱蚊剂量。以期为开展核桃种质资源利用提供参考依据，也为核桃叶片挥发性物质在医药、植物源挥发性物质研究和农副产品工业的开发与应用提供参考数据，对实现核桃资源多功能利用和产业可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 驱蚊植物供试材料 石竹烯、香叶醇、芳樟醇、罗勒烯、柠檬烯对白纹伊蚊（Aedes albopictus）具有强杀蚊活性，对新疆佳木果树学国家长期科研基地的核桃树进行筛选，选择‘美国东部黑核桃‘温185‘实生核桃和‘山核桃叶片为试验材料。采样树龄为9 年，株行距为4 m×6 m，生长健壮、无病虫害。每个品种选3棵样树，树形为开心形，从东、西、南、北4个方位进行收集，样品采摘大小相似。于2021年5、6、7和8月底，采摘同一株树相同部位、无病虫害且叶片完整的老叶，然后对收集的新鲜核桃叶片进行筛选，去除灰尘及其他杂质，阴干，粉碎，过40目筛，按样品号分别标记，称重后备用。

1.1.2 供试蚊虫 白纹伊蚊在飞凡标准技术服务有限公司养虫室内饲养。室内温度（temperature，T）（26±1）℃；相对湿度（relative humidity，RH）65%±10%；光周期（光照/黑暗）12 h/12 h，试验时选用整齐一致的健康3～5 d龄成虫。

1.2 核桃叶片挥发物制备

超声波水蒸气蒸馏法提取叶片挥发性物质，提取方法如下：准确称取‘温185‘山核桃‘实生核桃‘美国东部黑核桃4种核桃干叶片粉末20g，置于圆底烧瓶中，加入定量水，振荡混匀后置于超声波清洗器中（超声频率40 kHz、输出功率200W）进行超声处理，然后将圆底烧瓶放入电热套并连接冷凝管及挥发油提取器，回流提取。挥发油经无水硫酸钠干燥后，称重，根据公式（1）计算提取率[15]，于-4℃保存待用[16]。试验重复3次，结果取平均值。通过挥发油质量，比较同一种植物的不同提取时间、不同固液比、不同超声时间的提取率。

1.3 超声波水蒸气蒸馏法的正交试验设计

在单因素试验的基础上，以超声时间、提取时间、固液比为考察因素，采用3因素3水平正交试验，以核桃叶片挥发油提取率为指标，确定最佳提取条件[17]。正交试验设计见表1。

1.3.1 提取时间对挥发油提取率的影响试验 称取核桃叶片20 g，在设定固液比为1∶10（g·mL-1），超声时间为10 min，超声功率为200 W，提取时间分别为6、7、8、9 h的条件下，于挥发油提取装置中提取，研究不同提取时间对挥发油提取率的影响。

1.3.2 固液比对挥发油提取率的影响试验 称取核桃叶片20 g，在设定提取时间为8 h，超声时间为10 min，超声功率为200 W，固液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g·mL-1）条件下，利用挥发油提取装置提取，研究不同固液比对挥发油提取率的影响。

1.3.3 超声时间对挥发油提取率的影响试验 称取核桃叶片20 g，在设定提取时间为8 h，固液比为1∶10（g·mL-1），超声功率为200 W，超声时间分别为5、10、15、20 min 条件下，利用挥发油提取装置提取，研究不同超声时间对挥发油提取率的影响。

1.3.4 正交试验设计优化 采用正交试验设计，在综合单因素试验结果的基础上，以核桃叶片挥发油的提取率（%）为值，通过正交试验分析，进行挥发油提取条件的优化[18]。

1.4 驱蚊活性指标测定

1.4.1 驱避液制剂制备方法 将4种核桃叶片提取液使用乙醇稀释为4 个体积分数处理：10%、20%、30%、40%（以目前市场驱避剂中精油含量为依据），并对其进行蚊虫驱避试验测定，筛选出最佳驱蚊效果的含量水平。

1.4.2 驱蚊试验 实验室温度为25～27 ℃，相对湿度为60%～70%。将3个直径21 cm、长度43 cm的透明圆筒进行串联，3个圆筒之间用挡板隔开，两侧用挡板挡住，一边圆筒用透气纱网封口，中间圆筒预先放100只试验蚊虫，另一圆筒放入测试精油并用挡板密封。放入测试精油样品5 min后，同时抽开3 个圆筒间的2 块挡板，分别在5、10、15、20、45、60 min时将挡板插回并记录两边圆筒的蚊虫数量[19]，参照公式（2）计算驱蚊率。

1.5 数据统计分析

采用Excel 2016 进行试验资料的整理与统计，采用SPSS 26.0进行正交试验设计及显著性的差异分析。

2 结果与分析

2.1 提取时间对挥发油提取率的影响

由图1可见提取时间对核桃叶片挥发油提取率的影响，提取时间6～9 h，核桃叶片挥发油提取率‘ 温185为0.031 5%～0.037 0%、‘ 山核桃为0.032 0%～0.042 0%、‘ 实生核桃为0.025 0%～0.027 5%、‘ 美国东部黑核桃为0.034 5%～0.043 0%。不同提取时间下各核桃叶片挥发油提取率依次为‘美国东部黑核桃>‘山核桃>‘温185>‘实生核桃。随着提取时间的不断增加，挥发油的提取率先增加后减少，8 h时‘美国东部黑核桃挥发油的提取率最大，为0.043 0%。随着提取时间的延长，核桃叶片中的挥发油提取率不断增加，提取时间超过8 h后，挥发油已基本被提取出来，核桃叶片挥发油提取率开始缓慢降低，说明核桃叶片挥发油的最佳提取时间为8 h。

2.2 固液比对挥发油提取率的影响

由图2可以看出，固液比对核桃叶片挥发油提取率的影响，固液比1∶5～1∶20（g·mL-1）挥发油提取率‘温185为0.018 5%～0.030 5%，‘山核桃为0.020 5%～0.032 0%，‘实生核桃为0.014 5%～0.027 5%，‘ 美国东部黑核桃为0.023 0%～0.037 5%。在不同固液比下各核桃叶片挥发油提取率依次为‘美国东部黑核桃>‘山核桃>‘温185>‘实生核桃。随着固液比中水分的增加，挥发油的提取率先升高后下降，固液比超过1∶10（g·mL-1）之后，挥发油提取率开始下降。随着固液比中水分的不断增加，挥发油的释放空间充足，挥发油量将不会增加，而水溶液过多则会增加挥发油的溶解速度，不易收集水蒸气，所以随着固液比中水分不断增大，当超出一定范围时，挥发油提取率会有相应程度的减小[20]。固液比为1∶10（g·mL-1）时提取效果最佳，核桃叶片精油的提取率达到最大。

2.3 超声时间对挥发油提取率的影响

由图3可见，超声时间对核桃叶片挥发油提取率的影响，超声时间5～20 min时挥发油提取率‘温185为0.027 0%～0.037 5%，‘山核桃为0.025 0%～0.036 5%，‘实生核桃为0.019 5%～0.029 0%，‘美国东部黑核桃为0.029 5%～0.047 5%。不同超声时间下各核桃叶片挥发油提取率依次为‘美国东部黑核桃>‘温185>‘山核桃>‘实生核桃。超声波在一定程度上提高了核桃叶片挥发油提取率，随着超声处理时间的增加，其提取率呈递增趋势，当超声持续10 min后，提取率有所降低。随着超声时间的延长，细胞越容易破碎，有利于精油进入溶剂中；但由于精油是易挥发物质，提取时间过长，导致精油提取率下降[21‐22]。当超声时间为10 min时，核桃叶片精油的提取率达到最大。

2.4 正交试验结果分析

在单因素试验的基础上，以超声时间、提取时间、固液比为考察因素，采用3因素3水平正交试验，以核桃叶片挥发油提取率为指标，确定最佳提取条件[23]，正交试验结果见表2。从极差结果分析得出，3个因素对核桃叶片挥发油提取率的影响由强到弱顺序为提取时间>超声时间>固液比，提取时间的极差最大，为0.062，表明提取时间对核桃叶片挥发油提取量影响最大；固液比的极差最小，为0.030，表明固液比对核桃叶片挥发油提取量的影响最小；正交试验结果表明，在超声波处理时间为10 min的条件下，A2B2C2 为核桃叶片挥发油提取条件的最佳组合，即提取时间为8 h，超声时间为10 min，固液比为1∶10（g·mL-1）。

2.5 不同核桃叶片粗挥发油提取溶液的驱蚊效果分析

2.5.1 ‘温185叶片提取物溶液驱蚊效果 从图4可以看出，核桃叶片挥发油的含量水平不同，驱蚊效果也有所不同。通过对4种含量水平‘温185核桃叶片挥发油驱蚊效果的比较可以看出，其驱蚊率依次为30%处理>40%处理>20%处理>10%处理，30%含量水平的驱蚊时间最长，是驱蚊效果最好的处理水平，40% 含量水平挥发油效果比30% 处理效果稍差。在30% 含量水平下驱蚊时间达到20 min，说明‘温185叶片挥发油对蚊虫的驱避效果，在30%含量水平下效果最好。

2.5.2 ‘美国东部黑核桃叶片提取物溶液驱蚊效果 由图5可知，‘美国东部黑核桃叶片挥发油提取物随着时间的增加驱蚊率先增加后减小。4种含量水平‘美国东部黑核桃叶片挥发油驱蚊效果依次为30% 处理>40% 处理>20% 处理>10% 处理，30%含量水平叶片挥发油在前20 min内的驱蚊率为85.18%，具有最好的驱蚊效果。但是从20 min后驱蚊率开始下降，说明挥发油溶液在空气中挥发较快。

2.5.3 山核桃叶片提取物溶液驱蚊效果 由图6可知，‘山核桃叶片挥发油提取物溶液的驱蚊率由高到低依次为20%处理>40%处理>30%处理>10% 处理。20%、40% 和10% 含量水平下20 min时，其驱蚊率均达到最高，驱蚊效果较好，但从20 min后驱蚊率出现下降的趋势，直至60 min时20% 含量水平的驱蚊率下降为27.04%。30% 含量水平的挥发油提取物溶液不同于其他含量水平，30% 含量水平在15 min时驱蚊率达到最高，驱蚊效果较20%和40%含量水平稍差，当驱蚊时间为20 min时，30%含量水平的驱蚊率已经开始下降，且下降较快。‘山核桃叶片挥发油提取物溶液在20 min内20%、40%、30%和10%具有一定的驱蚊效果，其中挥发油提取物溶液含量水平为20%、驱蚊时间为20 min时驱蚊效果最好，驱蚊率达到最高，为68.82%。

2.5.4 ‘ 实生核桃叶片提取物溶液驱蚊效果 由图7可知，‘实生核桃叶片挥发油提取物随着时间的增加驱蚊率呈先增加后减小的趋势，‘实生核桃叶片挥发油不同含量水平驱蚊率由高到低依次为40%处理>30%处理>20%处理>10%处理，‘实生核桃叶片挥发油提取物稀释为40%水平、驱蚊时间为20 min时驱蚊率为63.40%，具有最好的驱蚊效果。

2.6 同一水平下不同核桃叶片驱蚊效果由表3所知，4个核桃样品叶片挥发油提取溶液均具有一定的驱蚊活性，不同含量水平下驱蚊效果有明显差异。‘美国东部黑核桃挥发油提取溶液在30%含量水平下效果最佳，驱蚊率可达到85.18%；其次是‘温185，驱蚊率达到84.11%；‘山核桃和‘实生核桃挥发油提取溶液驱蚊效果低于‘美国东部黑核桃和‘温185。可知4个核桃叶片挥发油提取溶液在30%含量水平下驱蚊效果由强到弱依次为‘美国东部黑核桃>‘温185>‘山核桃>‘实生核桃。

3 讨论

利用超声水蒸气蒸馏法提取核桃叶片挥发油，可以选择的因素较多。采用正交试验能全面地比较各因素之间的相互作用，并且通过正交试验的设计能分析出最优的提取方案，在核桃叶片挥发油的提取优化方面广泛应用。本试验得出超声水蒸气蒸馏法提取‘美国东部黑核桃叶片挥发油的最佳工艺条件为提取时间8 h，超声时间10 min，固液比1∶10（g·mL-1）。其中，核桃叶片粉末含量过多对核桃叶精油提取率有负影响，随固液比中水分的增加，挥发油提取率先增加后下降，当固液比增大到1∶10（g·mL-1）后提取率明显开始下降，可能是当核桃叶片与水溶液之间混合后扩散达到一定平衡，提取率反而降低，因为核桃粉末过多，固液比过大，蒸馏瓶容积太小，核桃叶片溶解不完全导致提取率降低[23]，这和Ravanfar等[24]的试验结果相一致。随着提取时间的延长，核桃叶片中挥发油成分不断析出，到达一定量后基本饱和，提取率趋于平缓，所以挥发油提取率先增加后减少，这与王艺茜[25]对桃叶最佳提取条件优化中结果一致。但张鹰等[26]在不同蒸馏提取时间对柚皮精油提取率的影响中得出，随着提取时间的延长，柚皮精油提取率增加，当提取时间达到2 h后，精油提取率趋于平缓，并没有下降，而本试验中核桃叶片挥发油提取率则先上升后下降。

核桃叶片挥发油的提取率随超声时间的增加，呈现先增加后下降趋势，当超声时间为10 min时提取率达到最大，10 min以后核桃叶片挥发油提取率随着超声时间延长开始缓慢下降。这与华燕青等[27]对薄荷挥发油的提取试验结果一致。但覃勇荣等[28]在对无患子总皂苷提取率研究过程中发现，随着超声时间的延长皂苷提取率逐渐下降。本试验中提取率的下降是由于超声时间的延长，大量核桃叶片细胞破碎且破碎程度增加，挥发油溶出较多，但是由于挥发油易挥发，提取时间过长，引起核桃叶片物质结构和组成的变化，导致核桃叶片挥发油提取率下降，所以核桃叶片挥发油提取率随超声时间的增加先增加后减小[29‐30]。同时，超声时间过长不仅增加了成本，而且可能影响精油成分[31]。本试验在影响核桃叶片挥发油的提取率单因素试验的基础上，将正交试验法应用于优化核桃叶片挥发油提取工艺中，确定提取时间为8 h，超声时间为10 min，固液比为1∶10（g·mL-1）为最佳提取条件。在此条件下，核桃叶片挥发油的提取率为0.475%，显著高于桃叶提取率[27]。本试验利用正交试验法对超声辅助水蒸气蒸馏法提取核桃叶片挥发油的提取方法进行优化，为后期提高核桃叶片挥发油的提取率及核桃叶片驱蚊精油的综合开发利用提供依据。

天然植物精油大多具有芳香性，毒性低，刺激性低，对人体和环境无害，使用安全，使嗅觉和感觉更容易接受[32‐33]。驱蚊试验发现，30%含量水平下‘美国东部黑核桃叶片挥发油提取溶液驱蚊效果最佳，在驱蚊时间为20 min 时，驱蚊率达85.18%，具有很好的开发前景。目前关于植物精油驱蚊效果的研究较多，但多集中于植物本身，而有关挥发性物质的有效组分和不同植物间的相互协作关系的探讨很少[34]。刘磊等[35]通过比较5种驱蚊植物及植物萃取液驱蚊效果发现，5种驱蚊植物提取液在2 h后均表现出不同程度的蚊虫驱避作用，且随着处理时间的延长，其作用由开始升高在20 min内逐渐降低，而在120 min内，香叶天竺葵没有显著的降低。这与本试验结果中核桃叶片挥发油提取物的驱蚊效果相一致。唐丽萍等[36]对4种植物精油驱蚊贴对白纹伊蚊的驱避效果的研究发现，香茅油驱蚊贴的驱避效果最好，高达78.2%，复方精油驱蚊贴的驱避率为56.0%，所有测试的驱蚊贴在24 h后驱蚊效果明显减弱。以30%含量水平核桃叶片的精油为驱蚊剂的最佳配比，但其作用不及市面上的驱蚊产品。考虑到核桃叶片的独殊香气和低成本，该产品与其他植物精油配合使用，能实现较好的驱蚊作用，是一种具有潜力的新型驱蚊剂。

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（责任编辑：胡立霞）