大蒜素调控VEGF/MAPK/ERK通路对缺血性脑卒中大鼠血管新生和神经保护的机制研究

张彩凤 张栋 李旭成 周勇 周芳

摘要目的：探讨大蒜素对缺血性脑卒中（IS）大鼠血管新生和神经保护的影响以及对血管内皮生长因子（VEGF）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的调控机制。方法：将90只无特定病原体（SPF）级SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（12mg/kg尼莫地平）、大蒜素低剂量组（大蒜素25mg/kg）、大蒜素高剂量组（大蒜素50mg/kg）、大蒜素高剂量＋VEGF抑制剂组［50mg/kg大蒜素＋5mg/kg贝伐单抗（Bmab）组］，每组15只。Morris水迷宫检测各组大鼠认知功能；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测脑梗死面积；苏木精伊红（HE）染色观察海马组织病理形态；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素1β（IL1β）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）水平；免疫组化法检测海马组织中血小板内皮细胞黏附分子（CD31）蛋白表达和微血管密度（MVD）；蛋白免疫印迹（WesternBlot）法检测海马组织中血管生成素1（Ang1）、VEGF、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）蛋白的表达。结果：与假手术组相比，模型组大鼠海马组织结构紊乱，细胞间隙变大，逃避潜伏期、脑梗死面积、TNFα、IL1β水平升高（P＜0.05），穿越平台次数、NGF、BDNF水平、CD31阳性细胞数量、MVD、Ang1、VEGF蛋白表达及pERK1/2/ERK1/2降低（P＜0.05）。与模型组相比，阳性对照组、大蒜素高剂量组、大蒜素低剂量组大鼠海马组织形态恢复，细胞间隙缩小，逃避潜伏期、脑梗死面积、TNFα、IL1β水平降低（P＜0.05），穿越平台次数、NGF、BDNF水平、CD31阳性细胞数量、MVD、Ang1、VEGF蛋白表达及pERK1/2/ERK1/2增加（P＜0.05）。大蒜素高剂量＋Bmab可抑制大蒜素作用，与大蒜素高剂量作用相反。结论：大蒜素可能通过激活VEGF/MAPK/ERK通路促进缺血性脑卒中大鼠的血管新生，从而发挥神经保护作用。

关键词缺血性脑卒中；大蒜素；血管内皮生长因子；丝裂原活化蛋白激酶；细胞外信号调节激酶；血管新生；神经保护；实验研究

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.013

缺血性脑卒中（ischemicstroke，IS）是导致残疾和死亡最常见的主要原因之一，通常会造成毁灭性的脑损伤，其主要是由于脑部血流量暂时或永久的缺失，导致氧气和葡萄糖水平下降、能量不足、组织梗死及其周围微血管密度增加［12］。因此，研究IS的治疗方法不仅需要恢复神经元，还需要促进整个神经血管的生成［3］。血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是血管发育的关键因子，能够刺激血管的生成。细胞外信号调节激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）为丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs）家族的关键成员，MAPK/ERK信号通路在多种生物活动中发挥不可或缺的作用［4］。有研究发现，VEGF能够介导MAPK/ERK信号通路，从而影响血管生成以及IS后的抑郁症状［56］。大蒜素（allicin）是从大蒜中提取出来的一种防御分子，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用，同时也可作为一种神经保护剂，具有改善认知功能障碍的作用［7］。大蒜素已经被证实能够保护缺血再灌注脑损伤的神经损伤，并促进脑梗死周围的血管生成［8］。但其中的作用机制尚不清楚，因此，本研究建立IS大鼠模型，探讨大蒜素其血管新生和神经保护的影响以及作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠90只，6周龄，体质量160～200g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）20190017。

1.2实验药品及试剂

大蒜素购自四川省维克奇生物科技有限公司；尼莫地平购自北京嘉林药业股份有限公司，国药准字H20054248；VEGF抑制剂贝伐单抗（Bmab）均购自美国MedChemExpress公司；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液购自北京普非生物科技有限公司；苏木精伊红（HE）染液购自北京伊塔生物科技有限公司；肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素1β（IL1β）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自上海酶研生物科技有限公司；血小板内皮细胞黏附分子（CD31）、血管生成素1（Ang1）、VEGF、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）一抗购自英国Abcam生物公司；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗购自武汉菲恩生物科技有限公司。

1.3大鼠模型制备

参照文献［9］中大脑中动脉栓塞（MCAO）方法制备IS大鼠模型，用1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，对颈部进行剃毛和消毒，在颈部中间位置做切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。然后将尼龙缝合线穿入颈内动脉中，以阻断右侧大脑中动脉血的供应，2h后拔出缝合线恢复供血，手术过程中保持大鼠体温在37℃左右。假手术组不使用缝合线插入，其余步骤相同。

1.4分组及给药

将造模后的大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（尼莫地平组）、大蒜素低剂量组、大蒜素高剂量组、大蒜素高剂量＋VEGF抑制剂组（大蒜素高剂量＋Bmab组），每组15只。假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，阳性对照组灌胃给药12mg/kg的尼莫地平［10］，大蒜素低剂量组、高剂量组分别灌胃给药25mg/kg、50mg/kg的大蒜素［8］，大蒜素高剂量＋Bmab组先灌胃50mg/kg的大蒜素，再腹腔注射5mg/kg的Bmab［11］。每天1次，持续14d。

1.5Morris水迷宫检测各组大鼠认知功能

给药14d后，对所有大鼠进行水迷宫实验，检测大鼠神经功能的损伤情况。准备1个直径1.5m的圆形水池，平均分成4个象限，水池正中央有1个直径12cm的逃生平台，置于水面下2cm的位置。将大鼠分别放入4个象限中，并引导其找到平台。训练第7天记录各组大鼠到达平台的时间，记为逃避潜伏期。随后撤去平台，从相同的位置放入大鼠，记录其1min内穿越原平台的次数。

1.6TTC染色检测大鼠脑梗死面积

水迷宫实验结束后，每组随机选取5只大鼠，并用40mg/kg的1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，断头，无菌条件下取全脑组织冻存于－20℃冰箱20min，沿冠状位置切片。将切片放入TTC溶液中，37℃水浴30min，染色结束放入4%多聚甲醛中固定10min，拍照并用ImageJ软件分析并计算梗死面积。

1.7HE染色观察大鼠海马组织病理形态

将剩余大鼠麻醉后断头处死，解剖脑部取海马组织冻存在－80℃，部分用4%多聚甲醛中固定并制作石蜡切片。然后将石蜡切片依次进行脱蜡，水化，苏木精染色，1%盐酸分化，伊红复染，再用乙醇、二甲苯分别脱水、透明，最后树脂封片，显微镜观察海马组织的病理形态。

1.8ELISA法检测大鼠血清中TNFα、IL1β、NGF、BDNF水平

所有大鼠在麻醉处死前进行腹主动脉采血，3000×g离心10min，取上清保存于－20℃。然后按照ELISA试剂盒的操作步骤检测血清中TNFα、IL1β、NGF、BDNF水平。

1.9免疫组化法检测大鼠海马组织中CD31蛋白表达和微血管密度（MVD）

将石蜡包埋的组织切片脱蜡。然后将切片浸泡在5%脱脂牛奶中封闭2h，加入CD31一抗，4℃孵育过夜，然后加入羊抗兔二抗孵育1h，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗后3，3′二氨基联苯胺（DAB）染色15min，最后树脂封片，使用ImageproPlus6.0软件分析CD31阳性细胞数，并计算MVD。

1.10蛋白免疫印记（WesternBlot）法检测大鼠海马组织中Ang1、VEGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表达

将冻存的海马组织放入匀浆器，加入蛋白裂解液匀浆，提取总蛋白并制备蛋白样品。用二喹啉甲酸（BCA）检测试剂盒测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）凝胶电泳分离蛋白条带并转膜，结束后聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于封闭液中封闭2h，然后加入一抗［甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）、Ang1、VEGF、ERK1/2、pERK1/2稀释比例为1∶1000］，4℃孵育过夜，再加入羊抗兔（稀释比例1∶2000），室温孵育2h，最后用增强化学发光试剂（enhancedchemiluminescence，ECL）显色。以GAPDH为内参蛋白，用凝胶成像系统拍照并分析蛋白含量。

1.11统计学处理

采用SPSS26.0软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两两之间多重比较用SNKq检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大蒜素对IS大鼠认知功能的影响

与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和大蒜素低剂量组、高剂量组大鼠逃避潜伏期时间缩短，穿越平台次数增多，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与大蒜素高剂量组相比，大蒜素高剂量＋Bmab组大鼠逃避潜伏期时间延长，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2大蒜素对IS大鼠脑梗死面积的影响

与假手术组相比，模型组脑梗死面积明显增加（P＜0.05）。与模型组相比，阳性对照组和大蒜素低剂量组、高剂量组脑梗死面积减小（P＜0.05）；与大蒜素高剂量组相比，大蒜素高剂量＋Bmab组脑梗死面积增大（P＜0.05）。详见图1、表2。

2.3大蒜素对IS大鼠海马组织形态的影响

与假手术组相比，模型组大鼠海马组织结构紊乱，细胞数量减少，出现坏死，且细胞间隙变大；与模型组相比，阳性对照组和大蒜素低剂量组、高剂量组海马组织形态不同程度恢复，细胞数量增多，坏死减少，细胞间隙缩小；与大蒜素高剂量组相比，大蒜素高剂量＋Bmab组海马组织损伤加重，形态与模型组相似。详见图2。

2.4大蒜素对IS大鼠血清TNFα、IL1β、NGF、BDNF水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清TNFα、IL1β水平升高，NGF、BDNF水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和大蒜素低剂量组、高剂量组血清TNFα、IL1β水平降低，NGF、BDNF水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与大蒜素高剂量组相比，大蒜素高剂量＋Bmab组血清TNFα、IL1β水平升高，NGF、BDNF水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

2.5大蒜素对IS大鼠海马组织CD31蛋白和MVD的影响

与假手术组相比，模型组大鼠海马组织CD31阳性细胞数减少，MVD降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和大蒜素低剂量组、高剂量组CD31阳性细胞数增多，MVD升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与大蒜素高剂量组相比，大蒜素高剂量＋Bmab组CD31阳性细胞数减少，MVD降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见图3、表4。

2.6大蒜素对IS大鼠海马组织中Ang1、VEGF、pERK1/2/ERK1/2蛋白的影响

与假手术组相比，模型组新生大鼠海马组织中Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和大蒜素低剂量组、高剂量组大鼠海马组织中Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.05）；与大蒜素高剂量组相比，大蒜素高剂量＋Bmab组Ang1、VEGF、pERK及pERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低（P＜0.05）。详见图4、表5。

3讨论

IS是一种复杂的疾病，其主要病因是血管内血栓的形成，由此导致神经血管系统受损，并破坏脑组织和神经元稳态，最终造成长期的运动和认知障碍［12］。因此，促进血管新生在恢复神经功能过程中有不可或缺的作用。本研究结果显示，模型组大鼠的逃避潜伏期较长，穿越平台次数较少，且脑梗死面积增大，海马组织结构紊乱，细胞数量减少，出现坏死，且细胞间隙变大，提示IS大鼠模型建立成功。在缺血性脑损伤中，炎性因子TNFα最早出现并参与刺激脑脊液和血清中的炎症过程；IL1β在接受脑缺血刺激后可激活具有促炎作用的其他因子，产生炎症反应［13］。NGF、BDNF等神经营养因子在缺血期间能够促进血管生成，诱导神经元的存活和再生［14］。CD31是评估微血管密度的生物标志物。本研究发现，模型组大鼠血清促炎因子TNFα、IL1β水平升高，NGF、BDNF水平降低，同时CD31阳性细胞数量减少，MVD降低，表明IS大鼠海马神经血管系统受损，且存在全身性炎症反应。大蒜素是一种具有抗炎、抗癌、降血压和改善糖尿病等作用的化合物。而且已经有研究发现大蒜素对缺血后的神经具有潜在的保护作用［15］。本研究结果发现，与模型组相比，阳性对照组和大蒜素剂量组大鼠的认知功能明显恢复，炎症反应减轻，神经营养因子表达增高，同时CD31阳性细胞数量及MVD增加，提示大蒜素可抑制炎性因子释放，促进神经营养因子产生，进而促进IS大鼠的血管再生，具有神经保护功能。但其中具体的分子作用机制尚未明确。

VEGF是一种有效的生长因子，在血管生成中发挥多种作用。据了解，在MCAO诱导缺血大鼠模型中，VEGF发挥神经保护、血管生成、神经发生等多种作用［16］。Ang1也是促进血管生成的重要因素，可以增强血管生成中其他细胞因子的作用并维持新血管形成的结构完整［17］。MAPKs作为关键信号转导因子，介导多种生物反应，在生理和病理过程中发挥关键作用。ERK是MAPK通路家族的主要成员，有ERK1和ERK2两种类型。磷酸化后，pERK1/2进入细胞核并调节转录因子的表达［18］。有研究发现，VEGF与其受体结合可以启动MAPK途径信号传导使ERK磷酸化［19］，丙酮酸激酶M2（PKM2）通过激活VEGF介导MAPK/ERK通路来改善IS后抑郁症状［6］，再次证实了VEGF能够修复IS引起的神经损伤和脑组织损伤［20］。本研究结果发现，模型组大鼠海马组织中Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低，阳性对照组和大蒜素剂量组Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高。表明大蒜素可激活VEGF/MAPK/ERK信号通路，这可能为其促进IS后血管新生、发挥神经保护作用的潜在机制。进一步使用VEGF抑制剂贝伐单抗发现，贝伐单抗可以消除大蒜素对IS大鼠血管和神经的保护作用。

综上所述，大蒜素可能通过激活VEGF/MAPK/ERK信号通路，促进IS大鼠血管新生，实现神经保护作用。本研究为IS神经恢复及血管生成提供了新的研究方向。但是其通路的下游影响因子还有很多尚未研究，因此大蒜素对血管和神经的具体作用机制还需进一步深入研究。

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（收稿日期：20221212）

（本文编辑郭怀印）

基金项目武汉市卫生健康委员会科研项目（No.WZ19A15）；湖北省卫生健康委员会项目资助（No.WJ2019H362）

作者单位武汉市中医医院（武汉430034），Email：zhangcaifeng1992z@163.com

引用信息张彩凤，张栋，李旭成，等.大蒜素调控VEGF/MAPK/ERK通路对缺血性脑卒中大鼠血管新生和神经保护的机制研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（6）：10401045.