烟碱对肠缺血再灌注损伤大鼠凝血功能的影响

汪海松 徐林梅 陈振毅 高海鹰 蔡东妙

[摘要] 目的 觀察胆碱能激动剂烟碱对大鼠肠缺血再灌注损伤后凝血功能的影响。方法 选取32只体质量250～300g雄性健康SD大鼠，采用随机数字表法将它们分为四组（n=8）：假手术（sham operation，S）组、肠缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）组、烟碱（nicotine，NIC）组、α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAchR）拮抗剂α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）组。大鼠肠缺血再灌注损伤模型采取肠系膜上动脉夹闭45min后恢复再灌注120min的方法建立。α-BGT组在肠系膜上动脉夹闭前45min和30min分别腹腔注射α-BGT 1μg/kg，烟碱400μg/kg；NIC组用等容量生理盐水替代α-BGT， S组和IR组用等容量生理盐水替代α-BGT和烟碱，其余均同α-BGT组。在大鼠恢复再灌注120min后经腹主动脉取血样，检测血浆肿瘤坏死因子-α（plasma tumor necrosis factor，TNF-α）、组织因子（tissue factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）、纤溶酶原激活物抑制物-1（fiber plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚体水平和血小板计数（platelet count，PLT）。取远端回肠采用Chiu评分法评估小肠组织受损程度。结果 与S组和NIC组比较，IR组和α-BGT组血浆TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚体水平均出现显剧升高，血浆AT水平下降，血小板计数下降（P<0.05），小肠组织Chiu评分增加（P<0.05）。结论 烟碱能够抑制大鼠肠缺血再灌注损伤导致的凝血功能过度激活；其作用机制可能为外周α7烟碱型乙酰胆碱受体结合，引起胆碱能抗炎通路的激活，进而导致促炎性细胞因子的释放减少，从而减轻内皮细胞的损伤。

[关键词] 肠缺血再灌注损伤；血液凝固；烟碱

[中图分类号] R656      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.14.010

Effect of nicotine on coagulation and fibrinolysis in intestinal ischemia-reperfusion injury rats

WANG Haisong， XU Linmei， CHEN Zhenyi， GAO Haiying， CAI Dongmiao

Department of Anesthesiology， the First Affiliated Hospital of Xiamen University， Xiamen 361003， Fujian， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nicotine on coagulation in intestinal ischemia-reperfusion injury rats. Methods 32 male Sprague-dawley rats， weighing 250-300g， were randomly divided into 4 groups （n=8）： sham operation group （S）， intestinal ischemia-reperfusion （IR） group， nicotine （NIC） group， α7 nicotinic acetylcholine receptor （α7nAchR） antagonist group α-bungarotoxin （α-BGT） group. Intestinal IR was induced by clamping superior mesenteric artery for 45min and 120min of reperfusion. In group NIC nicotine 400μg/kg was injected intraperitoneally at 30min before superior mesenteric artery occlusion. In group α-BGT 1μg/kg was injected intraperitoneally at 15min before superior mesenteric artery occlusion. Plasma tumor necrosis factor-α （TNF-α）， tissue factor （TF）， antithrombin （AT）， tissue plasminogen activator （tPA）， fiber plasminogen activator inhibitor-1 （PAI-1）， D-dimer levels and platelet count （PLT） were measured after 120min reperfusion. Chius count was used to assess the changes in intestinal mucosal pathlolgical morphology. Results Compared with group S and group NIC， the plasma TNF-α，TF， tPA， PAI-1 and D-dimer levels were significantly increased， and plasma AT level and platelet count were significantly decreased， in group IR and group α-BGT（P<0.05），Chius scores were significantly increased（P<0.05）. Conclusion Nicotine can inhibit the excessive activation of coagulation function in intestinal ischemia-reperfusion injury rats. Its mechanism may be related to activation of cholinergic antiinflammatory pathway， reducing the release of pro-inflammatory cytokines thereby reducing endothelial cell injury.

[Key words] Intestinal ischemia-reperfusion injury; Blood coagulation; Nicotine

肠缺血再灌注损伤是严重创伤、休克和肠移植等疾病常见的并发症，具有较高的发生率和病死率[1-2]。肠道屏障功能受损和细菌移位是肠缺血过程中的常见并发症，常导致活性氧和炎性细胞因子的过度释放，甚至出现细胞凋亡。炎性细胞因子大量的释放进入循环系统，造成内皮细胞受损，从而引起抗凝和纤容抑制，导致血管内外纤维蛋白沉积，出现凝血和纤溶功能紊乱，使得微循环障碍进一步加剧，最终导致多器官衰竭[3-4]。前期研究表明，大鼠内毒素血症导致的凝血和纤溶功能紊乱，可以通过电刺激足三里穴使胆碱能抗炎通路激活，进而导致炎性细胞因子的释放减少从而得到明显的改善[5]。因此，本研究拟通过夹闭肠系膜上动脉复制大鼠肠缺血再灌注损伤动物模型，探讨胆碱能激动剂烟碱对大鼠肠缺血再灌注损伤时凝血功能的影响。

1  材料与方法

1.1  实验动物与分组

SPF级健康雄性Sprague Dawley 大鼠32只，年龄6～8月，体质量250～300g，由厦门大学实验动物中心提供[实验动物许可证号：SYXK（闽）2018-0009]。将实验动物采用随机数字表法分为4组，每组8只：①假手术（sham operation，S）组；②肠缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）组；③烟碱（nicotine，NIC）组；④α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAchR）拮抗剂α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）组。

1.2  模型制备

大鼠肠缺血再灌注损伤模型采用参考文献[6]中结扎肠系膜上动脉的方法制备。动物自由饮水，在实验开始前12h停止进食。通过腹腔注射50mg/kg 的1%戊巴比妥纳对大鼠进行麻醉，大鼠麻醉成功后仰卧固定于鼠板上，经常规消毒后铺巾，沿着腹部正中切开约3.5cm的切口进入腹腔，游离大鼠肠系膜上动脉后，用无损伤动脉夹将其夹闭，45min后松开动脉夹以恢复再灌注。待肠系膜上动脉重新恢复搏动后将肠管回纳入腹腔并逐层关腹。S组仅分离不夹闭肠系膜上动脉，α-BGT组在肠系膜上动脉夹闭前45min和30min分别腹腔注射α-BGT 1μg/kg，烟碱400μg/kg。NIC组用等容量生理盐水替代α-BGT， S组和IR组用等容量生理盐水替代α-BGT和烟碱，余均同α-BGT组。

1.3  标本采集

在大鼠恢复再灌注120min后，通过腹腔注射50mg/kg 1%戊巴比妥纳麻醉大鼠，将2.7ml取自于腹主动脉的血样于含枸橼酸钠抗凝管中并持续静置15min，再在4℃的离心机（3000g）离心10min，收集离心后的上清液，贮存于–20℃冰箱中待用，血浆中瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、组织因子（tissue factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）、纤溶酶原激活物抑制物-1（fiber plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚体水平采用ELISA法来测定。取血1ml置于含乙二胺四乙酸二钾盐抗凝采血管中，使用全自动血细胞分析仪进行血小板计数。取离回盲瓣5cm处小肠组织制成标本，进行小肠组织损伤病理评分。

1.4  小肠组织损伤病理评分

采用10%甲醛溶液固定远端回肠，进行石蜡包埋，常规制备HE染色切片，并在光学显微镜下观察小肠病理损伤情况，参考文献[7]采用Chiu评分法评判小肠黏膜损伤程度。

1.5  统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

IR组和α-BGT组血浆中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚体水平与S组相比均出现明显升高，而AT水平则降低，血小板计數减少（P<0.05），小肠组织Chiu评分增加（P<0.05）；IR组和α-BGT组血浆中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚体水平与NIC组相比均出现明显升高，AT水平降低，血小板计数（platelet，PLT）减少（P<0.05），小肠组织Chiu评分增加（P<0.05）。见表1，表2。

3  讨论

肠缺血再灌注损伤是导致临床危重症患者出现多器官衰竭的重要原因，其病理生理机制主要是过度释放炎症细胞因子、趋化因子和氧自由基，从而造成局部和远隔器官受损，同时伴有血管内皮细胞的损伤[8-9]。研究显示，肠缺血再灌注时血管内皮细胞受损，从而激活凝血系统，抑制纤溶系统，最终出现微循环功能障碍[2]。

机体的主要抗凝系统为AT系统和TF系统，其中AT在缺血再灌注损伤时直接抑制内皮细胞上的糖胺的表达和凝血酶的蛋白水解活性，其是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。在感染时，AT因为合成受阻及消耗过多等原因常常导致其水平下降[3，10]。当肠缺血再灌注损伤发生时，机体释放大量的炎性细胞因子TNF-α，导致血管内皮细胞过度的释放TF、TF与凝血因子FⅦa或Ⅹa形成复合物激活外源性的凝血系统[11]。TF-FVIIα复合物又可以引起TNF-α的合成和释放。TNF-α激活炎性细胞因子级联反应，诱导TF表达，进一步促进炎症级联反应与凝血反应的相互作用，形成一个持续不断的恶性循环[12]。在生理性凝血过程中血小板起着关键性的作用，在急性炎症反应时，凝血功能出现异常，是由于血小板大量被消耗所致。本实验结果显示，IR组小肠组织Chiu评分、血浆TNF-α和TF明显高于S组，AT和血小板较S组降低，证明模型制备成功。

在正常生理状态下，血液中的tPA水平维持在一个特定的水平内，当出现急性炎症反应时，TNFα刺激血液中PAI-1水平升高，血管内皮细胞释放大量的tPA入血，随后tPA与PAI-1形成复合物，抑制纤溶功能，导致血管内纤维蛋白降解物D-二聚体增[13]。

本實验选择给予烟碱的时机和剂量是根据文献[14]来确定的，结果发现，大鼠小肠组织Chiu评分在肠缺血再灌注损伤后显剧升高，血浆中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚体水平上升，而AT含量与血小板计数下降，大鼠小肠组织Chiu评分在给予烟碱处理后明显低于IR组，且与IR组相比血浆中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚体水平降低，AT水平及血小板计数增加，这说明烟碱对大鼠肠缺血再灌注损伤的炎症反应具有抑制作用，并使紊乱的凝血功能得到改善。而在预先给予α7烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂α-银环蛇毒素后，烟碱对大鼠炎症和凝血功能的改善被阻断，表明烟碱对肠缺血再灌注大鼠凝血功能的影响主要通过与外周α7烟碱型乙酰胆碱受体结合而发挥作用的。

烟碱对肠缺血再灌注损伤时凝血功能的影响可能是通过与外周α7烟碱型乙酰胆碱受体相结合，导致胆碱能抗炎通路被激活，从而抑制炎症反应，进而导致紊乱的凝血和纤溶功能得到改善。炎症系统和凝血系统在肠缺血再灌注损伤时相互激活，其中炎性细胞因子TNF-α在激活凝血系统时发挥了关键作用。有研究表明，TNF-α可造成机体组织因子过度表达，进而引起凝血系统的激活，并抑制抗凝血和纤溶功能[15-16]。研究证明，α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂能够抑制肠上皮细胞在缺氧/复氧条件下发生的炎症反应和氧化损伤，其主要机制是通过胆碱能抗炎通路的激活来实现的[4]。刘薇等[14]经研究后发现，烟碱对内毒素大鼠凝血和纤溶功能具有明显的改善作用，其机制可能是烟碱与α7烟碱型乙酰胆碱受体结合，通过胆碱能抗炎通路的激活来抑制炎症反应而发挥作用。

综上所述，预先给予烟碱，可以有效地改善肠缺血再灌注损伤大鼠凝血功能，其作用机制可能是烟碱与外周α7烟碱型乙酰胆碱受体结合，继而激活胆碱能抗炎通路，导致炎性细胞因子的释放减少，从而减轻内皮细胞的损伤。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

• 录亚鹏， 刘洋， 郝伟， 等. 细胞焦亡在肠缺血再灌注损伤中作用的研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学， 2021， 26（12）： 1437–1443. 
• 张伟， 王迎斌， 曹璐， 等. 自噬在肠缺血再灌注损伤中的研究进展[J]. 中国临床药理学与治理学， 2022， 9： 1061–1066
• 侯小煜， 冷玉芳， 曹雪芬， 等. Nrf2信号通路在肠缺血再灌注损伤中的作用机制的研究进展[J]. 兰州大学学报（医学版）， 2022， 48（10）： 81–85. 
• WANG H S， CAI D M， CHEN Z Y， et al. GTS-21 promotes α7 nAChR to alleviate intestinal ischemia- reperfusion-induced apoptosis and inflammation of enterocytes[J]. Med Sci Monit， 2020， 26： e921618. 
• 汪海松， 蔡东妙， 徐林梅， 等. 电针足三里穴对大鼠肠缺血再灌注时凝血功能的影响[J]. 中华麻醉学杂志， 2017， 07： 865–868. 
• 李青文， 谢景远， 崔珊珊， 等. PI3K/Akt信号通路在丙泊酚减轻大鼠肠缺血再灌注损伤中的作用[J]. 中华麻醉学杂志， 2019， 39（3）： 319–322