石榴蔗糖代谢相关酶SPS和INV基因家族鉴定与表达分析

冯立娟　李英朋　王传增　尹燕雷　郭琳　谭伟

摘要：蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖转化酶（INV）是蔗糖代谢的关键调控酶，在植物生长发育过程中起重要作用。本研究利用生物信息學和荧光定量PCR等分子手段，鉴定石榴SPS和INV基因家族成员，分析其理化性质、保守结构域、保守基序、二级结构、亚细胞定位、系统进化关系和表达模式。结果表明，从石榴基因组中鉴定出4个SPS基因和11个INV基因，其编码蛋白均为不稳定蛋白，具有典型的保守结构域，家族成员间特征motif数量和种类大致相同，蛋白结构高度保守：这些蛋白不均匀地分布在染色体上，均定位于叶绿体中，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。石榴SPS和INV基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系，与巨桉同源性较高；不同SPS和INV基因在石榴果实不同发育时期的表达模式存在差异，PgINV3在9月15日（果实增大期）表达水平最高，显著高于其他时期。本研究结果对解析石榴果实中蔗糖代谢的分子机理具有重要意义。

关键词：石榴：SPS基因：INV基因：生物信息学分析：基因表达

中图分类号：S665.4：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）03-0011-08

石榴（Punica granatum L）是我国重要的特色果树之一，果实营养价值高，保健功能强，越来越受到消费者青睐。山东石榴栽培历史悠久，种质资源丰富，发展面积日益增加，成为山东省打造乡村振兴齐鲁样板的良好选择。果实品质提升是提高石榴市场竞争力的重要途径。蔗糖积累是决定石榴果实风味和品质的重要因子，在其生长发育和产量形成过程中起重要作用。研究石榴果实蔗糖代谢机理对其果实品质调控具有重要的理论意义。

蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）催化尿苷二磷酸葡糖（UDPG）和果糖-6-磷酸（F6P）生成蔗糖-6-磷酸（S6P），S6P在蔗糖磷酸酯酶（SPP）作用下不可逆形成蔗糖。SPS是植物体内控制蔗糖合成的关键酶，由多基因家族编码，在不同物种中的成员数量不同，且同一物种中不同家族成员调控蔗糖合成的能力也不相同。目前已在柑橘和甜樱桃中鉴定出4个SPS基因，在苹果和梨中鉴定出8个SPS基因。蔗糖转化酶（invertase，INV）不可逆地催化蔗糖裂解为果糖和葡萄糖，分为酸性细胞壁转化酶（CWIN），酸性液泡转化酶（VIN）和碱性／中性转化酶（A/N-Inv）。在草莓中鉴定出8个Fa，A/N-Inv基因家族成员，其中4个不仅具有组织特异性，还具有果实发育阶段特异性和品种特异性表达特点，受细胞分裂素、赤霉素和生长素诱导。过表达SoSPS1基因可提高转基因甘蔗叶片的SPS活性和蔗糖含量，提高可溶性酸性转化酶（SAI）活性及葡萄糖和果糖水平。

目前，国内外在石榴蔗糖代谢方面的研究甚少，SPS和INV基因家族成员鉴定与表达方面的研究尚未见报道。因此，本研究基于全基因组测序结果对石榴SPS和INV基因家族成员进行鉴定，分析其理化性质、保守结构、二级结构及系统进化关系等生物信息学特性，并解析其在果实发育过程中的表达模式，以期为深入研究石榴果实蔗糖积累的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 石榴SPS和INV基因家族成员鉴定

从NCBI数据库中下载PgSPS和PgINV蛋白序列，与石榴全基因组（ASM765513v2）数据库进行同源比对，初步获得SPS和INV候选序列。通过Pfam在线数据库（http：//pfam.xfam.org）进行进一步的蔗糖合成结构域（PF00862）、糖基转移结构域（PF00534）和蔗糖-6-磷酸磷酸水解酶结构域（PF05116）验证。利用SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de）进行蛋白结构域分析，去除结构不完整的序列，最终确定目的基因。

1.2 石榴SPS和INV基因家族成员生物信息学分析

利用在线软件ProtParam预测石榴SPS和INV蛋白分子量、等电点、脂肪系数等理化性质。利用CDD和MEME软件分析保守结构域和保守基序。利用SOPMA和Plant-mPLoc软件预测二级结构和亚细胞定位。

1.3 系统进化树构建

使用MEGA6.0软件，采用NJ法（neighbor-joining）对石榴、苹果、葡萄和巨桉的SPS和INV蛋白进行系统进化树构建。Bootstrap值设为1000，去除Bootstrap支持率低于50%的节点，显示各分支长度。

1.4 荧光定量表达分析

2022年7月15日开始采集‘泰山红石榴果实，分别在7月30日、8月15日、8月30日、9月15日、9月30日采1次，直至果实成熟（10月15日）。利用RNA prep Pure Plant Kit试剂盒提取籽粒总RNA，反转录成cDNA。使用SYBR GreenPCR Master Mix试剂盒、利用BIO-RAD IQ5实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR分析。每个样品设3次生物学重复。采用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1）。以石榴Actin（GU376750.1）为内参，默认条件下读取Ct值，相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.5 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2010进行数据处理及作图，用SPSS 19.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 石榴SPS和INV基因家族成员鉴定

从石榴中鉴定出4个SPS基因和11个INV基因，分别命笔为PgSPS1-PgSPS4和PgINV1-PgINV11（表2）。通过分析蛋白理化性质可知，4个SPS蛋白的氨基酸数量在1029-1067之间，相对分子量在114816.80-119337.14 Da范围内：等电点在6.26-6.72之间，均在酸性范围内：脂肪系数在84.87-87.92之间，不稳定系数在42.60-49.65范围内，均为不稳定蛋白。11个INV家族成员的氨基酸数量在531-679范围内，等电点在5.62-7.58之间：脂肪系数为79.48-94.80.不稳定系数介于43.62-55.16之间，也均为不稳定蛋白。

2.2 石榴SPS和INV蛋白保守结构域分析

PgSPS1、PgSP52和PgSPS3蛋白属于PLN00142超级家族成员，其中PgSPSI和PgSP53包含糖基转移酶（Clycos_transf_1）保守结构域，PgSPS2含GlycosVltransferase_GT保守结构域；Pg-SPS4也含有Glycos_transf_1保守结构域（图1）。

PgINV5和PgINV10含有Glyco_hydro_100糖基水解酶结构域。除PgINV5外，其余10个INV蛋白均含有GDB1结构域。

2.3 石榴SPS和INV蛋白保守基序分析

由图2可见，4个SPS家族成员的保守基序数量均为7，且均为Motif2、Motif9、Motif11、Mo-tif12、Motif13、Motif14和Motif15基序。11个INV家族成员均包含12个保守基序，分别为Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6、Motif7、Mo-tif8、Motif9、Motif10、Motif11和Motif12。同一基因家族成员间的保守基序数量和种类大致相同。

2.4 石榴SPS和INV各成员蛋白的二级结构与亚细胞定位

又表3可见，石榴SPS和INV蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成，以α-螺旋和无规则卷曲占比较高；其中，Pg-SPS3及PgINV1、PgINV2、PgINV6、PgINV7、Pg-INVII各组分占比表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角，其他蛋白则均表现为α-螺旋>无规则卷曲>延伸链>β-转角。亚细胞定位预测表明，石榴SPS和INV家族成员均定位于叶绿体中。

染色体分布显示，pgSPS1和PgSPS2位于Chr1，其余两个SPS基因位于Chr2。PgINV1、PgINV6、Pg-INV10、PgINV11位于Chr1，PgINV4和PgINV5位于Chr4，PgINV7和PgINV8位于Chr6，PgINV2、PgINV3和PgINV9分别位于Chr2、Chr3和Chr7。

2.5 石榴SPS和INV基因系统进化树分析

用4个石榴SPS蛋白、5个巨桉SPS蛋白、9个苹果SPS蛋白和10个葡萄SPS蛋白构建系统进化树（图3A），可分为两大类。PgSPS1、PgSP52和PgSPS4聚为一类，其中PgSPS1和Pg-SPS2聚为一小类。PgSPS3则与EgSPS2、MdSPS2和MsSPS2聚为一类，亲缘关系较近。

11个石榴INV蛋白、9个巨桉INV蛋白、7个苹果INV蛋白和10个葡萄INV蛋白的系統进化树如图3B所示，也主要分为两大类。在第一大类中，PgINV2、PgINV7和PgINV8聚为一类，其中PgINV2与EgINV2聚为一小类，PgINV7和Pg-INV8聚为一小类：PgINV6、PgINV10和PgINV11聚为一类，其中PgINV6与EgINV5亲缘关系较近，PgINV10和PgINV11缘关系较近。在第二大类中，PgINV1与EgINV4聚为一类，PgINV3与PgINV5亲缘关系较近。PgINV4与PgINV9聚为一类，其中PgINV4与EgINV3、EgINV6聚为一小类，PgINV9与EgINV8亲缘关系较近。

2.6 PgSPSs和PgINVs基因表达分析

本研究选用2个SPS基因（PgSPS2和PgASPS4）、6个INV基因（PgINV2、PgINV3、Pg-INV4、PgINV7、PgINV9、PgINV11），均以7月15日的表达量为1，分析其在石榴果实发育期的表达模式，结果（图4）显示，两个SPS基因均下调表达，但随着石榴果实发育进程的推进，其变化趋势存在差异，PgSP52表现为降→升→降→升→降→升的较规律波动变化，PgSPS4则表现为降→升→降→升，均以9月15日的表达水平较高。PgINV2整体下调表达，随着生育进程的推进呈先降低后升高的变化趋势；PgINV3在7月30日、9月15日和10月15日上调表达，以9月15日的相对表达量最高，8月30日的相对表达量最低；PgINV4、PgINV7和PgINV9在石榴果实发育期间的表达水平较低，除PgINV7在8月15日下调表达较少外，其余时期均明显下调表达：PgINV11的变化趋势与PgINV3相似，但仅在9月15日明显上调表达。

3 讨论与结论

蔗糖是植物体内光合产物从“源器官”运输到“库器官”的主要形式，是影响产量和果实品质形成的重要因素。SPS和INV是蔗糖代谢的关键调控酶，影响植物生长发育过程中的生物量形成和糖分积累。本研究从石榴中鉴定出4个SPS基因，其编码蛋白均为不稳定的酸性蛋白，与柑橘和甜樱桃中的数量一致：鉴定出11个INV基因家族成员，均为不稳定蛋白，数量少于无籽蜜柚而多于草莓。

通过对蛋白保守结构域和保守基序分析发现，石榴SPS和INV蛋白均具有典型的保守结构域，家族成员间特征motif数量和种类大致相同，蛋白结构高度保守，这表明石榴SPS和INV基因家族在进化上具有保守性，这与苹果和猕猴桃上的研究结果一致。其中，PgINV5和Pg-INV10具有中碱性蔗糖转化酶典型的Glyco_hydro_100糖基水解酶结构域，等电点分别为6.30和6.53，有可能是中碱性蔗糖转化酶，这与黑皮果蔗和南瓜中的研究结果相似。

蛋白质二级结构的预测与空间结构分析对了解其功能具有重要意义。石榴SPS和INV蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，延伸链和β-转角所占比例较低，说明α-螺旋和无规则卷曲在石榴SPS和INV蛋白结构中起重要作用，这与甘蔗中的研究结果相似。本研究发现，石榴SPS和INV家族成员不均匀地分布在染色体上，均定位于叶绿体中，其精确定位和调控功能还需深入研究。系统进化树分析表明，石榴SPS和INV基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系，石榴与巨桉、苹果的SPS基因家族成员同源性较高，与巨桉的INV基因家族成员同源性较高。这进一步证实了石榴与巨桉的亲缘关系较近，为深入研究石榴SPS和INV基因家族成员的生物学功能奠定了理论基础。

本研究进一步对2个SPS基因和6个INV基因在石榴果实不同发育时期的表达模式进行了分析，发现其在不同时期的表达量存在差异。在9月15日（果实增大期），PgSPS2和PgSPS4的相对表达量较高，PgINV3和PgINV11的相对表达量显著高于其他时期。说明石榴SP^S和INV基因家族不同成员调控蔗糖代谢的功能具有特异性，这与甘蔗和萱草中的研究结果一致。

综上，不同SPS和INV基因调控石榴果实蔗糖代谢的机理存在差异，具有发育时期表达特异性，后续将从转录调控、功能鉴定、蛋白互作等方面深入研究石榴SPS、INV基因家族成员调控蔗糖代谢的分子机理。

基金项目：枣庄学院山东省石榴精深加工工程技术研究中心／山东省石榴资源综合开发工程实验室开放课题（SLKF2021001）；山东省重点研发计划项目（2022TZXD009）；山东省农业科学院农业科技创新工程项目（CXGC2023A12）；山东省农业科学院揭榜科技难题项目（SHJB2022-42）