靶向血管生成素/酪氨酸蛋白激酶-2（Ang/Tie2）通路的脓毒症治疗药物的研究进展

姜萌，薛立超，郝淑兰，仲启明，冯玛莉，王晞星*，吉海杰*

1.山西省中医院 山西省中医药研究院，山西 太原 030012

2.山西白求恩医院 山西医学科学院，山西 太原 030032

脓毒症是一种由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征，常伴有器官功能障碍、组织灌注不良、低血压甚至脓毒性休克，全球每年约530 万人因此死亡[1-2]。脓毒症的发病机制涉及全身炎症网络效应、免疫功能障碍、凝血功能异常和宿主对病原微生物及其毒素的异常反应多个方面[3]。现有治疗手段主要依赖抗生素、血管活性药物、糖皮质激素、机械辅助通气等对症治疗[4]。血管功能障碍与脓毒症之间存在明确的关系[5-6]，血管功能和通透性受内皮特异性受体酪氨酸激酶及其配体调节，包括血管内皮生长因子（VEGF）/血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血管生成素（Ang）/酪氨酸蛋白激酶（Tie）受体[7]。VEGF 信号通路介导血管发生和病理血管生成，但抗药性的产生限制了VEGF 信号通路抑制剂的使用[8]。

血管生成素1（Ang1）是强效的血管稳定因子，当与Ang 家族受体Tie2 结合时，可使酪氨酸蛋白激酶-2（Tie2）磷酸化，可激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸激酶（Akt）信号通路，同时抑制Rho A，降低血管通透性，维持血管内皮动态屏障功能，并通过核因子（NF）-κB 调节细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达，减少白细胞的黏附和组织浸润，发挥抗炎功效[9-11]。血管生成素2（Ang2）与Ang1 的蛋白结构基本相同，但其生物学功能完全不同，在受到炎症、缺氧等触发后，Ang2 快速释放，与Ang1 竞争性结合Tie2，引发血管通透性的增加，导致血管稳态失衡[12]。Tie2 的磷酸化在很大程度上取决于激动剂配体Ang1 和抑制剂配体Ang2 两者存在的比例，同时Tie2 磷酸化可激活 Akt，导致叉头盒蛋白 O1（FOXO1）转录因子的磷酸化，抑制Ang2 的产出，避免形成恶性循环[13]。在感染引发的脓毒症中，炎症因子、内毒素等释放到血液中，引起Ang/Tie2 轴动态调控失衡，导致血管内皮紧密连接受损，血管通透性增加，进一步引发微循环灌注不足，从而导致局部组织缺氧和组织器官损伤。白蛋白、病原微生物等随血浆外渗至血管外，引起水肿、低蛋白血症、全身感染甚至休克[14-15]。临床研究表明，脓毒症患者血液Ang1 水平下降，Ang2 水平升高，提示Ang1 和Ang2 可作为脓毒症的标志物，辅助诊断、预后评估和对患者风险分层[16]，具有替代序贯器官衰竭评估的潜在临床应用价值[17]。表明Ang/Tie2 信号通路可以作为控制炎症、防止血管渗漏药物研发的重要靶点，为脓毒症治疗提供新的可能性[18-22]。

当前，研发靶向Ang/Tie2 信号通路的药物成为补充VEGF 抑制疗法的主流策略，该通路在控制血管稳定性、治疗脓毒症方面具有独特作用[23]，目前多处于临床前和临床试验阶段，基本策略主要包括补充外源或促进内源Ang1 表达、抑制内源性Ang2表达和激活Tie2 以及它们的联合作用。靶向Ang/Tie2通路的脓毒症治疗药物有重组人Ang1腺病毒、Ang1 类似物、Ang2 抑制剂、重组人Ang2 和Tie2激动剂。本文总结了靶向Ang/Tie2 通路的脓毒症治疗药物的研究进展，以期为脓毒症治疗药物的开发提供思路。

1 重组人Ang1 腺病毒

2005 年 Witzenbichler 等[24]证实静脉注射1×109空斑形成单位（PFU）的重组人Ang1 腺病毒（AdhAng1）可显著增加脂多糖诱导脓毒性休克模型小鼠存活率，并认为这与其改善模型小鼠血液动力学、缓解肺损伤、降低肺组织炎性黏附分子表达有关，提示重组人Ang1 腺病毒有益于脓毒症的治疗。随后Ziegler 等[25]发现iv 5×1012病毒粒子的重组Ang1 腺相关病毒（AAVAng1）可逆转内皮细胞特异性Ang2 高表达小鼠的血液动力学障碍和毛细血管周细胞数量减少，进一步还观察到Ang2 抗体治疗可缓解脂多糖诱导脓毒症小鼠的血液动力学障碍，并将模型小鼠36 h 死亡率从95%降低到61%。除此之外，iv 1×109PFU 编码人类Ang1 的腺病毒载体（AdAng1）有效维持了实验性脑疟疾（ECM）中Ang1 缺陷小鼠血脑屏障的完整性，与生理盐水组相比，14 d 存活率由3.7%提高至61%[26]。这些发现证实了构建Ang1 过表达带来的益处，然而腺病毒作为递送载体用于人类治疗时可能产生免疫反应，甚至肿瘤的风险，因此如何降低风险、发挥保护性作用成为进一步开发研究的重点。

2 Ang1 类似物

2.1 vasculotide

Tournaire 等[27]发现一种短合成肽（HHHRHSF），该肽与Tie2 受体的细胞外部分具有高亲和力，将其与四聚体聚乙二醇支架以物质的量比12∶1 进行合成，得到一种新型聚乙二醇簇状 Tie2 激动剂vasculotide[28]。与操纵Ang1 或Ang2 表达的干预措施不同，vasculotide 是一种Ang1 模拟物[29]，对Tie2受体具有高度特异性，可直接激活受体及其下游途径，诱导体内持久的Tie2 活化，并且不会取代Ang1或Ang2。vasculotide 治疗已被证明可以防止70%～80%致死率浓度的脂多糖诱导的C57 小鼠肺血管内皮屏障功能障碍，逆转钙黏蛋白的衰减，并提高生存率（造模前7 h ip 500 ng vasculotide 提高41.4%，造模后2 h ip 500 ngvasculotide，14 h 时再ip 250 ng提高33.3%）[30]。Kumpers 等[31]在盲肠结扎穿孔前16、1 h ip 200 ng vasculotide，并于造模后18 h 进行组织学分析，结果vasculotide 通过减少内皮黏附分子表达减少肾脏中的白细胞浸润，此外还降低了盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症小鼠血清和腹腔灌洗液中炎症因子（TNF-α、IL-6）、中性粒细胞（KC/CXCL1、MIP-2/CXCL2）和巨噬细胞（MCP-1/CCL2）的循环细胞因子水平，改善终末器官功能，并降低死亡率（造模前16、1 h 以及造模后24、48 h ip 200 ng vasculotide 风险比为0.39；造模后2、24、48 h ip同等剂量风险比为0.22）。同课题组另在体外研究中表明，vasculotide 对腹膜巨噬细胞的释放或中性粒细胞的迁移没有影响，证实了其内皮特异性作用。此外，在类似于典型脓毒症患者表现的严重流感小鼠模型中观察到，每日ip 500ng vasculotide 减少了肺水肿、动脉低氧血症和肺内皮细胞凋亡，从而提高存活率，即使延迟至感染后72 h 予以治疗，也实现了70%存活率的显著保护作用[32]。重要的是，vasculotide 的生产成本低廉，化学结构稳定，且与任何Tie2 配体无关，因此vasculotide 可能是治疗脓毒血症的一种新颖实用的药物。

2.2 重组人Ang1（rh-Ang1）

rh-Ang1 是R&D 公司生产的重组人血管生成素1，Mammoto 等[33]在内毒素信号传导细胞实验中发现，30 min 时Rac1 活性提高250%，且RhoA 活性抑制50%，继而增强E-钙黏蛋白连接，阻止细胞骨架重排和通透性过高，从而阻断内毒素介导的间质水肿和白细胞浸润以及血管渗漏，并在脂多糖诱导的小鼠模型中证明，ip10 μg×2 剂rh-Ang1 预处理可以阻断内毒素诱导白细胞浸润到肺实质。当注射给接受盲肠结扎穿孔的小鼠时，其稳定了血管内皮屏障功能，防止肺毛细血管渗漏，并通过抑制细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达减少白细胞浸润到肺实质和肾脏[34]，尽管rh-Ang1 具有重组蛋白药物普遍半衰期短的特点，但治疗仍能显著改善各种脓毒症相关器官功能障碍，并增加盲肠结扎穿孔后的生存时间[35-36]。然而rh-Ang1 治疗可能存在包括肺动脉高压、淋巴管发芽和增生以及急性肾损伤后的纤维化和炎症的不良反应[37-39]，使用时需衡量利弊。

2.3 BowAng1

BowAng1（REGN108）是Davis 等[40]将Ang1蛋白的C 端纤维蛋白原样结构域与人IgG Fc 片段融合，经过工程改造为四聚体以实现最佳的Tie2 磷酸化，临床前实验发现，ip 25 mg/kg BowAng1 联合7.5 mg/kg 青蒿琥酯治疗，即使是在感染后第5 天给药，仍显著降低伯氏疟原虫ANKA（PbA）感染的实验性脑疟疾小鼠的血管通透性，保持血脑屏障的完整性，与单独使用青蒿琥酯相比提高25%的存活率，100%的小鼠存活至14 d 实验结束[26]，并且这种设计形式在肾肿瘤模型中也被证明可以增强血管稳定性[41]。肾脏肿瘤发病机制中的血管通透性增大与脓毒症具有高度的相似性，为BowAng1 进一步在脓毒症模型中试验奠定基础。

2.4 MAT-Ang1/COMP-Ang1

由于重组Ang1 蛋白的大规模生产受到蛋白质聚集和不溶性的阻碍，且纯化后蛋白质的活性有所减弱，因此Dames 等通过用软骨基质蛋白[CMP，亦称matrilin-1（MAT）][42]、软骨寡聚基质蛋白（COMP）[43]的短螺旋卷曲结构域替换Ang1 的N-端部分开发出溶解性佳、更稳定有效的Ang1 变体MAT-Ang1（三聚体）、COMP-Ang1（五聚体）[44]。其中MAT-Ang1 在脓毒症发作后20 h iv 33 μg 可改善脂多糖诱导的小鼠血管渗漏、炎症和组织灌注不足[45]。COMP-Ang1 在原代培养内皮细胞中对细胞活性影响最强，其诱导的Tie2/Akt 磷酸化持续时间可达3～5 h，而自然分泌的Ang1 仅维持1～2 h[46]。并且在小鼠角膜血管生成实验中，300 ng COMPAng1 植入6 d 后观察发现，其可以抵消VEGF 诱导的血管渗漏，在体内形成内皮完整、状态稳定的功能性血管，表现出较600 ng 天然Ang1 更强的治疗潜力[44]。当在内毒素血症期间注射COMP-Ang1 时，可以防止脂多糖诱导的小鼠肾脏血流动力学功能减弱和黏附分子表达，从而预防由内毒素血症引起的急性肾损伤[47]。然而，COMP-Ang1 是一种大蛋白（约1.75×105），生产、纯化和储存期间仍不够稳定，因此Oh 等通过定点修饰链间二硫半胱氨酸键创建CMP-Ang1 的二聚体形式（CA1-3），其以N-糖相关性方式激活Tie2，并刺激血管生成，体外实验表明，CA1-3 是一种更易构建、相对分子质量更小（约7×104）且有效（与COMP-Ang1 有相似水平）的Ang1 类似物，已被证明在小鼠耳损伤模型中可以诱导血管管径增大，并阻止体内血管通透性增大[48]。

2.5 MSC-AngPT1

MSC-AngPT1 是Mei 等用来源于骨髓的间充质干细胞（MSC）转染人Ang1基因质粒从而塑造Ang1过表达的一种Ang1 类似物[49]。在气管内滴注800 μg 脂多糖可诱导急性肺损伤模型，30 min 后通过小鼠右颈静脉缓慢输注100 μL MSC-pAngPT1（含2.5×105细胞数），并于3 d 后取出组织分析发现，AngPT1 有效阻止了炎症细胞浸润到肺部，维持败血症期间肺内皮的完整性，并几乎完全逆转脂多糖诱导的肺通透性增加，其中支气管肺泡灌洗液中IgM 和白蛋白水平的降低分别为96%、74%，显著改善了急性肺损伤和更严重的急性呼吸窘迫综合征[49-50]。并在注射MSC 后，小鼠肺中可持续2 周检测到MSC 来源的细胞，其对Ang1 起着协同增效作用[50]。

3 Ang2 抑制剂

3.1 Angpt2-siRNA

Angpt2-siRNA 是Stiehl 等[51]以脂质体载体DACC 将其特异性递送至肺血管内皮的一种Ang2小干扰RNA。研究发现，脓毒症发生时，肺内皮细胞是Ang2 分泌的主要来源部位，造模前48 h 或造模后10 min 通过尾静脉注射300 μL Angpt2-siRNA（3.8 mg/kg），并于造模后16 h 进行评估，发现其可以使盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症小鼠肺中Ang2 表达降低73.8%，同时增强Tie2 的磷酸化，降低肺部炎性细胞因子IL-6 水平和ICAM-1 表达，同时减轻中性粒细胞器官浸润、血管渗漏，并改善肾功能，降低整体疾病严重程度，提高生存率，脂多糖模型也同样证实了上述现象。其功能抑制了Ang2与Tie2的结合，减轻了败血症和急性呼吸窘迫综合征模型中的血流动力学功能减弱，减少休克的发生，并降低死亡率[52]。

3.2 LC10（RO5485202）、LC06（RO5314193）

Thomas 等[53,25]从人抗体库中获得抗Ang2 抗体LC10（RO5485202）、LC06（RO5314193）的结合结构域，并将获得的VH 和VL 区域成熟化，融合到人IgG1 抗体的恒定部分，之后通过基因合成生成所需的基因，PCR 扩增并克隆到HEK293-F 系统中，用于瞬时表达的表达质粒变体中，从而构造新型Ang2 抗体。尽管LC10 预处理并不能阻止炎症细胞因子TNF-α、IL-6 水平的增加，但其阻断了脂多糖诱导的全身炎症小鼠微循环系统通透性增加，减缓了内毒素血症发展早期（0～12 h）在心脏和周围肌肉中观察到的周细胞丢失，但不会对中性粒细胞迁移造成显著影响。全身性低血压、微血管功能受损是脓毒性休克的标志，这种血流动力学改变造成的高死亡率在36 h 即可进展到95%，而ip 20 mg/kg LC06、LC10 在造模前24 h 预处理均可显著降低这一速率，并在10 h 内增加平均血压和存活率，LC10 在盲肠结扎穿孔模型中也同样被证明降低了死亡率。

4 重组人Ang2（rh-Ang2）

与rh-Ang1 类似，rh-Ang2 也是R&D 公司生产的重组人血管生成素2 蛋白。看似矛盾的是，Tzepi等[54]在多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）诱导的败血症小鼠中发现了Ang2 的保护作用，无论是在接种细菌前2 h 预处理还是接种后30 min 使用，生存率均显著提高，与对照组相比，25 μg/kg rh-Ang2组中性粒细胞对肝脏的浸润升高。同样，rh-Ang2 预处理可防止大肠杆菌引起的脓毒症相关死亡。然而，其未能在脂多糖诱导的小鼠中提供保护。当MDR-PA 接种于U937 细胞时可诱导炎症因子IL-6、TNF-α 的分泌，而Ang2 的加入降低了血清TNFα 水平，消除了TNF-α 与MDR-PA 的协同作用。实验发现，当脓毒症诱因为多微生物时，rh-Ang2 通过调节TNF-α 的产生和中性粒细胞的迁移从而展现出保护作用。Safioleas 等[55]在25 例急性肾盂肾炎和脓毒症临床患者以及40 只急性肾盂肾炎兔子模型中同样证实了这一存活机制。尽管rh-Ang2 可以通过与循环脂多糖的反向动力学从而逆转MDRPA 和大肠杆菌引起的脓毒症所致死亡，但Ang2 的出现仍会介导血管完整性丧失，甚至进展为休克，由此表明rh-Ang2 具有双刃剑特征，且对于脓毒症诱因具有特异性，因此明确rh-Ang2 的应用范围，并进一步发挥其保护作用成为开发的重点。

5 Tie2 激动剂

5.1 ABTAA

Han 等[56-58]发现了一种新型Ang2 靶向抗体（ABTAA），不同于标准抗体对其活性的单纯阻断，ABTAA 与Ang2 结合时，会促使Ang2 及其受体Tie2 在该部位聚集，通过将抗体-抗原簇转化为Tie2激活配体的机制，从而允许Ang2 抑制和Tie2 活化同时发生。其通过对内皮糖萼的保护来增强血管内皮屏障功能，并减轻血管渗漏和器官损伤，对于炎症带来的损害具有显著改善，生存提高率与传统的Ang2 阻断抗体ABA 相比显著提高，在盲肠结扎穿孔诱导的败血症中由13%提高至40%，在内毒素血症中由33%提高至63%，在金黄色葡萄球菌菌血症中由9%提高至55%。3 种小鼠模型均证明ABTAA在对脉管系统、微血管功能障碍、终末器官损伤和死亡率的保护方面更有效。这些研究同时强调了Tie2 激活的重要性，仅阻断Ang2 不足以在严重脓毒症期间保持血管内皮的完整性，联合型抗体具有更显著的疗效。

5.2 Razuprotafib（AKB-9778）

Razuprotafib 是一种皮下给药的血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶（VE-PTP）的高度特异性抑制剂，同时也是一种新型的Tie2 激活剂，2010 年由Akebia Therapeutics 公司在专利中首次提出用于治疗炎性疾病如败血症等引起的血管渗漏综合征[59]。Razuprotafib 可以激活Tie2，继而激活Rac1，并使RhoA 失活，同时触发Rap1 蛋白的激活，并降低肌球蛋白轻链2（MLC2，也称为MYL2）的磷酸化，从而稳定内皮肌动蛋白细胞骨架，增强EC 连接，阻止炎症介质诱导的通透性增大和白细胞外渗。Miles 测定显示，在测定开始前5、0 h 各静脉注射1 次16 mg/kg Razuprotafib 显著抑制了10 min 后皮内注射225 ng 组胺或100 ng VEGF 诱导的C57 小鼠皮肤中的血管渗漏。10 mmol/L Razuprotafib 同样阻断了200 ng/mL VEGF 诱导的单层人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性增大[60]。另外，24 mg/kg Razuprotafib 被证明可以明显抵消吸入40 min 雾化脂多糖诱导的小鼠4 h 后肺部血管渗漏和60%的中性粒细胞外渗，其对内皮连接的稳定作用取决于Tie2 的表达，而Tie2/Rap1 介导的影响在Cdh5基因敲除小鼠中被发现甚至能够脱离血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）直接加强内皮连接，改善小鼠的血管内皮屏障功能[61]。研究表明，脂多糖注射使大鼠产生全身炎症、可溶性血管内皮钙黏蛋白（sVE-cadherin）水平升高，继而诱发微血管内皮屏障功能丧失，微循环灌流量减少，并且sVE-cadherin会干扰VE-cadherin 介导的EC 间连接，并扰乱VEPTP/VE-cadherin 的相互作用，使RhoA 激活，而Razuprotafib 减轻了这一系列反应[62]。除此之外，其在肿瘤、眼病和新型冠状病毒感染等领域中也有广泛应用，已在临床Ⅱ期中进行测试[63-67]。Razuprotafib的出现表明可以通过激发Tie2 活性来稳定EC 连接，而不需要在EC 连接处增加或积累Tie2 分子，为调节Tie2 治疗脓毒症提供了另一种潜在机制。

6 结语和展望

及时识别和诊治对于脓毒症患者的预后至关重要[68]。Ang/Tie2 轴在维持内皮屏障稳定性方面起着至关重要的作用，其在全身感染期间的失调会导致病理级联反应，最终导致终末器官衰竭和死亡。除了在脓毒症病理生物学中的机制作用外，Ang/Tie2系统的组成部分还可以作为疾病严重程度和结局的预后生物标志物，并可能作为脓毒症管理的重要治疗靶点。

得益于生物医学手段的发展和各种基因蛋白结构数据库的大规模扩展，通过重组蛋白、腺病毒载体、蛋白工程改造、细胞转染、基因编辑等手段已实现对Ang/Tie2 系统表达、激活的有效干预，为脓毒症治疗药物的开发创造了便利条件。

这些药物在临床前各类脓毒症模型中表现出良好效果，但在临床试验中的证据较缺乏。腺病毒载体、重组蛋白等方式在带来益处的同时也存在不良反应，对于应用于人体的可靠性仍存在争议。因此，进一步设计并筛选适用于临床的快速、安全、有效的治疗药物成为首要任务。同时还需要努力寻找和开发新兴的治疗脓毒症方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突