基于网络药理学和分子对接探讨糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的作用机制

杨锐锋，亓智玮，刘聪毅，王宁，黄泳欣，李雯婧，吴丽丽，秦灵灵，刘铜华*

1.北京中医药大学 中医学院，北京 102488

2.北京中医药大学 教育部中医养生学重点实验室，北京 100029

3.北京中医药大学 科技处，北京 100029

糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病常见的慢性并发症，是指排除其他病因的情况下，患者出现肢体麻木、疼痛或其他异常感觉等周围神经功能障碍相关症状的疾病[1]。糖尿病周围神经病变诊断主要依靠糖尿病病史筛查、临床症状和体征及神经电生理检查，患者通常会出现四肢对称性疼痛，尤其是远端疼痛，最典型表现为手套样、袜套样的感觉[2-3]。糖尿病周围神经病变的发病率较高，据研究显示糖尿病患者患病5、10、20 年后，发病率分别达到30%、60%、90%[4]。糖尿病周围神经病变的发病机制目前尚不完全明确，可能与糖脂代谢紊乱、氧化应激、炎症反应亢进、神经营养因子缺乏、凋亡与自噬等相关[5]，病理改变主要表现为神经脱髓鞘或轴索变性[6]。目前临床治疗多使用营养神经、抗氧化应激、醛糖还原酶抑制剂、改善微循环药物等疗法，虽然取得了一定的疗效，但存在不良反应较明显且易复发等缺点[7-8]。糖尿病周围神经病变是导致下肢截肢和神经性疼痛残疾的主要原因，对患者的生活质量造成严重影响，仍需新的干预方法[9]。

根据糖尿病周围神经病变的症状和体征，中医学理论将其归属于“消渴病痹证”。糖脉康颗粒是治疗糖尿病并发症常用中成药，由葛根、丹参、赤芍、黄芪、生地黄、熟地黄、牛膝、桑叶、黄连、黄精、淫羊藿11 味药组成，具有补气活血、化瘀通痹的功效。糖脉康颗粒在《中医临床诊疗指南（2016 年版）》中被推荐为治疗糖尿病周围神经病变气虚血瘀证药物（弱推荐，Ⅱa 级）[10]，并且有系统评价与Meta分析表明，糖脉康颗粒能提高临床有效率、改善周围神经症状、提高神经传导速度和改善血糖水平，且不增加不良反应发生率，有较好的应用前景[11]。

网络药理学是一个能预测药物治疗疾病作用机制的方法，通过已研究出的大量生物学信息数据库，构建“药物-靶点-疾病”的生物网络，分析三者之间可能的关联。现已成为中药作用机制研究的重要方法，能提供新的药物研发策略，推动中药复方的深入研究[12-13]。糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变应用前景较好，但其药理学作用仍有待研究。本研究拟通过网络药理学探究糖脉康颗粒活性化合物及治疗糖尿病周围神经病变的分子机制和特征靶点，为后续动物和细胞水平实验进一步阐释药理学作用提供预测参考分析，以期为临床合理用药决策提供依据。

1 资料与方法

1.1 化学成分筛选

在中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）数据库（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索糖脉康颗粒组成药物葛根、丹参、赤芍、黄芪、熟地黄、牛膝、桑叶、黄连、黄精、淫羊藿的有效化学成分，并进行药动学筛选，筛选标准为口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18，采用PubMed、CNKI 数据库检索相关文献，对TCMSP 数据库未收录的药物生地黄的活性成分和其他药物未收录或未通过药动学筛选但有相关文献报道的成分进行收集。

1.2 共同靶点预测

在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索预测活性成分获取Canonical SMILES式，然后在SwissTargetPrediction 平台进行靶标预测，剔除无对应靶标信息或预测靶标Probilitity＜0.1。以“Diabetic peripheral neuropathy”为检索词检索Genecards 数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https://www.omim.org/）、TTD 数据库（https://db.idrblab.net/ttd）和DisGeNET 数据库（/https://www.disgenet.org/）的糖尿病周围神经病变疾病相关靶点，Genecards 数据库的靶点采用Score中位数值限制。采用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn）对靶点信息进行映射，得到药物-疾病共同靶点，并绘制韦恩图。

1.3 药物-活性成分-靶点-疾病的网络可视化

采用Cytoscape 软件（v3.7.2）对关键化学成分与疾病的共同靶点的相互关联信息进行图像可视化处理，对节点的度值（degree）、接近中心性和中介中心性进行拓扑参数分析，构建药物-活性成分-靶点-疾病网络图。节点表示活性成分和靶点，边表示节点之间相互作用的关系。degree 表示一个节点和其他节点相连的路线的条数，与其他节点关联连接越多，代表该节点重要性越高。

1.4 PPI 网络构建及核心基因筛选

将药物和疾病交集靶点导入 String 数据库（https://string-db.org/），生物体种类选择“Homo sapiens”，设置隐藏网络中的离散点，调整最低要求交互得分参数，导出PPI 网络图。将蛋白质相互作用关系数据导入Cytoscape 软件，对靶点的degree进行拓扑参数分析，筛选出PPI 网络中的关键基因。

1.5 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

采用R 软件（v4.2.1）及Bioconductor 程序包对药物-疾病共同靶点进行GO 功能生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和KEGG 信号通路富集分析，设定阈值P＜0.05 为显著相关，物种为“Homo sapiens”，并绘制相应柱状图和气泡图。

1.6 分子对接

在RSCB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中获取PPI 网络中按degree 值排序的前5 个核心靶点蛋白结构，设置来源生物为Homo sapiens，解构方法为X-RAY DIFFRACTION，优先选择分辨率高[至少＜3 Å（1 Å=0.1 nm）]、有三维结构、有蛋白与配体的复合物。下载蛋白质3D 结构pdb 格式文件，导入PyMOL 软件（v2.5）进行去除水分子、分离原始配体，在AutoDock Vina 软件（v1.1.2）加氢、计算电荷，保存为pdbqt 格式。在TCMSP 和PubChem数据库获取关键活性成分的mol2 格式文件，加氢、计算电荷、设置可旋转键后保存为pdbqt 格式。设定原配体位置为活性口袋中心，对接盒子大小设置40×40×40（相邻格点间距为0.375 Å），将活性成分和关键靶点蛋白在AutoDock Vina 软件（v1.1.2）中进行分子对接[14]，以分子对接结合能评估两者的结合关系。分子对接过程中其结合能的绝对值越高，代表受体与配体的亲和力越好，本研究选取结合能≤-5.0 kcal/mol（1 cal=4.2 J）作为关键活性成分与核心靶点有效结合的筛选依据[15]。

2 结果

2.1 糖脉康颗粒活性化学成分

检索TCMSP 数据库糖脉康颗粒包含药物，其中OB≥30%和DL≥0.18的活性成分葛根含有4个，丹参含有65 个，赤芍含有29 个，黄芪含有20 个，熟地黄含有2 个，牛膝含有20 个，桑叶含有29 个，黄连含有14 个，黄精含有12 个，淫羊藿含有23 个。经检索文献补充葛根1 个成分葛根素[16]，丹参1 个成分丹酚酸B[17-18]，黄芪1 个成分黄芪甲苷Ⅳ[19]，生地黄5 个成分梓醇、毛蕊花糖苷、水苏糖、地黄苷D、密力特苷[20-22]。共同活性成分和文献检索补充成分情况见表1。

表1 糖脉康颗粒的部分活性成分Table 1 Part of active ingredients of Tangmaikang Granules

2.2 糖脉康颗粒和糖尿病周围神经病变共同靶点

搜索 PubChem 数据库获取活性成分的Canonical SMILES 式，在Swiss Target Prediction 平台进行靶标预测，剔除无对应靶标或靶标Probilitity＜0.1。其中β-谷甾醇、谷甾醇和γ-谷甾醇，赤芍中的芍药苷和paeoniflorin 检索得到的结构一致，只保留其中一个成分，最终共剩下137 个活性成分，经去重后共得糖脉康颗粒作用靶点992 个。糖尿病周围神经病变疾病相关靶点检索GeneCards 数据库经限制后共得到1 701 个，OMIM 数据库共得到501 个，DisGeNET 数据库共得到129 个，TTD 数据库共得到2 个，合并去重共得糖尿病周围神经病变相关靶点2 115 个。在微生信平台对药物疾病靶点取交集绘制韦恩图，共获得糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的133 个可能活性成分的331 个潜在作用靶点，见图1。

图1 糖脉康颗粒和糖尿病周围神经病变共同靶点韦恩图Fig.1 Tangmaikang Granules and DPN common target Venn diagram

2.3 药物-活性成分-靶点-疾病网络可视化

采用Cytoscape 软件构建药物-活性成分-靶点-疾病网络，网络共有477 个节点和3 326 条边。进行网络参数拓扑分析，degree 平均值为13.945，接近中心性平均值为0.415，中介中心性平均值为0.003，保留degree 大于平均值以上的节点，设置节点的大小与其degree 呈正比。生地黄成分作用靶点按degree 平均值筛选时被剔除，葛根、熟地黄经筛选后剩下成分与其他药物相同故未单独列出。8 个菱形节点表示糖脉康颗粒组成药物，72 个V 型节点代表靶点，中间12 个圆形节点表示药物共同包含的成分，黄精包含5 个独有活性成分，赤芍包含4 个独有活性成分，牛膝包含3 个独有活性成分，黄芪包含10 个独有活性成分，黄连包含4 个独有活性成分，丹参包含24 个独有活性成分，桑叶包含10 个独有活性成分，淫羊藿包含6 个独有活性成分。乙酰胆碱酯酶（ACHE，degree＝57）在靶点中degree 最高，提示可能为关键作用靶点。degree 排名前3 位的活性成分为来自牛膝和黄连的巴马汀（degree＝84），来自黄连和淫羊藿的广玉兰内酯（degree＝58），来自桑叶的11,14,17-三烯酸甲酯（degree＝52），这些成分可能在糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变中发挥关键作用，见图2。

图2 药物-活性成分-靶点-疾病网络图Fig.2 Network diagram of drug-active ingredient-target-disease

2.4 PPI 网络及关键基因

将331 个药物和疾病共同靶点导入String 数据库以获取蛋白相互作用关系，隐藏游离节点并设置最低要求交互得分设置为0.990后导出关系网络图。将蛋白相互作用关系tsv 格式数据导入Cytoscape 软件并进行拓扑参数分析，得到的网络图含有158 个节点，304 条边，degree 平均值为3.85，中位数为2，其中节点表示靶标蛋白，每条边表示蛋白之间的作用关系。degree 排名前5 位的靶点分别为细胞肿瘤抗原p53（TP53，degree＝27）、连环蛋白β-1（CTNNB1，degree=25 ）、热休克蛋白90-α（HSP90AA1，degree＝25）、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基α（PIK3R1，degree＝19）信号转导和转录激活因子3（STAT3，degree＝19），表明这些靶点可能在糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变中具有重要作用，见图3。

图3 PPI 网络关键基因筛选图Fig.3 PPI network key gene screening map

2.5 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集柱状图柱状长度表示富集到此通路的基因数目，结果显示BP 显著相关3 396 条，包括细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、对营养素水平的反应（response to nutrient levels）和肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）等；CC 显著相关172 条，包括膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）和膜区（membrane region）等；MF 显著相关318 条，包含蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity ）和细胞表面受体蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）等，见图4。KEGG 富集共获得199 条信号通路，气泡大小表示富集到此通路的基因数目，取富集程度P值前10 位的通路。糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的关键靶点蛋白主要富集的通路包括糖尿病并发症中的高糖基化终产物-高糖基化终产物受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）和癌症的中枢碳代谢（central carbon metabolism in cancer）等，见图5。

图4 GO 功能富集分析柱状图Fig.4 GO functional enrichment analysis bar graph

图5 KEGG 富集分析气泡图Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis bubble graph

2.6 分子对接

选取关键活性成分巴马汀、广玉兰内酯、11,14,17-三烯酸甲酯和经实验验证的葛根素、丹酚酸B、黄芪甲苷Ⅳ、梓醇，分别和PPI 网络中度值前5 位的核心靶点TP53、CTNNB1、HSP90AA1、PIK3R1、STAT3 通过AutoDock Vina 软件进行分子对接模拟计算，分子对接结果见图6。活性成分与核心靶点分子对接结果显示糖脉康颗粒中关键活性成分与核心靶点的结合能≤-5.0 kcal/mol，表明关键活性成分与核心靶点可能具有较好的结合活性。选取各靶点蛋白结合能较低的对接结果通过PyMOL 软件进行可视化，TP53 的VAL-147 与葛根素形成氢键，CTNNB1 的ASN-206、THR-205 与梓醇形成氢键，HSP90AA1 的LYS-112、SER-52、ASP-93、ASN-51 与丹酚酸B 形成氢键，PIK3R1 的TYR-813与巴马汀形成氢键，STAT3 的SER-636、GLU-638与黄芪甲苷Ⅳ形成氢键，见图7。

图6 关键活性成分与核心靶点分子对接结合能Fig.6 Binding energy of molecular docking of key active components and core targets

图7 活性成分与核心靶点分子对接结果Fig.7 Molecular docking results of key active components and core targets

3 讨论

糖尿病周围神经病变中医学本无具体病名，因其为糖尿病常见并发症，又以疼痛、麻木或异常感觉为主要症状，2010 年国家中医药管理局颁布的《22 个专业95 个病种中医诊疗方案》中将本病中医病名正式确定为“消渴病痹证”[23]。糖尿病周围神经病变病因病机复杂，多本虚标实、虚实夹杂。以771 名糖尿病周围神经病变患者为样本的数据挖掘文献显示，糖尿病周围神经病变本虚以气虚、阴虚为主，标实以血瘀为主，常见证候依次为气阴两虚血瘀、气阴两虚、湿热淤阻、湿浊淤阻等，气虚和血瘀在糖尿病周围神经病变发生发展过程扮演重要角色，补气活血为糖尿病周围神经病变最基本的治疗方法[24]。数据库医案文献分析也证实血瘀、气虚、阴虚最为常见证素，气阴两虚、瘀阻经络为主要证型[25]。糖脉康颗粒组方来源于《丹溪心法·消渴方》、《景岳全书·玉女煎》和《金匮要略·肾气丸》，广泛应用于临床治疗糖尿病及其并发症。糖脉康颗粒含药血清自由基清除实验发现，该药具有体外抗氧化作用[26]。系统评价表明糖脉康颗粒在提高神经传导速度且安全性较好[27-28]，而目前尚未见糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的机制研究，因此本研究通过网络药理学系统分析糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的潜在重要靶点和作用通路。

网络药理分析显示糖脉康颗粒中所含的133 个可能活性成分中巴马汀、广玉兰内酯、11,14,17-三烯酸甲酯在与靶点网络中具有较高的中心性。巴马汀为黄连、牛膝含有的生物碱，可以降低db/db 小鼠的空腹血糖和血脂含量并减轻氧化应激反应[29]。链脲佐菌素糖尿病模型大鼠试验发现巴马汀能抑制伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78 和钙网蛋白的表达，可能激活了抗氧化蛋白，保护细胞免受活性氧类和内质网应激[30]。广玉兰内酯存在于黄连和淫羊藿，计算机虚拟分子对接结果与α-葡萄糖苷酶具有较强的结合活性，有通过抑制该酶活性延缓肠道碳水化合物吸收，从而调整血糖水平、治疗糖尿病的潜力[31]。11,14,17-三烯酸甲酯存在于桑叶，目前相关文献较少，后续可开展相关研究以验证其有效性。葛根素为葛根提取单体，目前已广泛应用于糖尿病并发症的临床治疗。体外实验表明，丹酚酸B 可下调可能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶p38 激活的炎症和细胞凋亡来治疗糖尿病周围神经病变[32]。黄芪甲苷Ⅳ通过上调miR-155 表达来抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的活化，增强细胞自噬以减轻由施旺细胞凋亡引起的糖尿病周围神经病变的髓鞘损伤[18]。梓醇是从地黄提取的抗氧化剂，已被证明具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和抗纤维化的特性，从而对糖尿病并发症产生有益的作用[33]。

筛选出331 个潜在作用靶点的degree 最高为ACHE，PPI 网络中degree 排名前3 位的靶点蛋白为TP53、CTNNB1、HSP90AA1。ACHE 通过快速水解释放到突触裂缝的乙酰胆碱来终止信号转导神经肌肉接点，在神经元凋亡中有重要作用。TP53 根据生理环境和细胞类型诱导生长停滞或凋亡，抑制肿瘤的形成。TP53 基因多态性与糖尿病周围神经病变发病有关，并且2 型糖尿病患者血清TP53 水平显著升高可能反映慢性高血糖所引致的新陈代谢及氧化应激[34-35]。CTNNB1 是Wnt 信号通路的主要下游成分，在中医辨证为肾虚证糖尿病组中荧光定量PCR 检测CTNNB1 的表达水平与非肾虚证糖尿病组相比较有表达上调的趋势，但差异不显著[36]。HSP90AA1 可促进特定靶蛋白的成熟、结构维持和适当调节，参与细胞周期控制和信号转导。血糖波动近年来被认为是糖尿病并发症和治疗靶点的促进因素，有研究运用基因优先级分析发现了HSP90AA1可能是与血糖波动相关的新的候选基因[37]。

GO 分析显示，糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的靶基因涉及细胞对化学应激的反应、对营养素水平的反应和肽基酪氨酸磷酸化等生物过程，膜筏、膜微域和膜区等细胞组成，蛋白酪氨酸激酶活性、细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶活性、细胞表面受体蛋白激酶活性等分子功能。KEGG 富集分析所涉及的通路有糖尿病并发症中的高糖基化终产物-高糖基化终产物受体信号通路、脂质和动脉粥样硬化和前列腺癌等。AGEs 来源主要为外源性的食物和烟草及内源性体内蛋白质的氨基部分与还原糖的羰基的代谢产物，RAGE 主要负责与配体结合后的信号转导、诱发相关基因上调[38]。AGE-RAGE 信号通路可被血液中过高的葡萄糖与循环中大分子物质激活，使AGEs 在细胞内外广泛积聚，促进细胞凋亡和基底膜增厚，导致血管和神经病变的发生[39]。显著富集的信号通路中也存在着部分调控其他疾病的通路，例如脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性等信号通路。人体是一个有机整体，机体代谢相互关联，糖脉康颗粒可能通过作用于多种信号通路发挥治疗糖尿病周围神经病变的作用。分子对接结果显示，糖脉康颗粒中4 个关键活性成分与3 个核心靶点的结合能均≤-5.0 kcal/mol，说明网络药理分析预测的成分可能与靶点结合较好。

综上所述，糖脉康颗粒可通过巴马汀、广玉兰内酯、11,14,17-三烯酸甲酯等多种有效成分，作用于TP53、CTNNB1、HSP90AA1 等位点起到抗氧化应激等作用，进而治疗糖尿病周围神经病变的作用。但是，网络药理学分析选择不同数据库和方法学结果可能有差异，并且存在中药材的用药部位、有效成分筛选标准等问题导致预测成分多为槲皮素等黄酮类化合物的现象。本次分析中葛根素等成分经实验验证但均未通过药动学筛选并且预测靶点数目较少，这使得网络药理学预测分析结果可信度应谨慎看待[40]。本研究仅基于网络药理学和分子对接初步探究糖脉康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的可能作用靶点及相关通路，但其具体机制仍需深入探讨，后续仍需在细胞和动物水平更进一步阐明验证糖脉康颗粒在治疗糖尿病周围神经病变方面的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突